电压门控氯离子通道ClC-7在小鼠牙齿发育中的作用研究

发布时间：2020-05-15 04:50

【摘要】： 牙齿的发育是一个长期、复杂的生物学过程,包括上皮间充质相互作用、细胞分化、形态发生、组织矿化和萌出,在这一过程中有众多生物因子参与并互相协调构成调控牙齿发育的信号网络。氯离子通道是生物体内一种重要的阴离子通道,它们在细胞膜和胞内细胞器质膜的跨膜转运中起着特定的生物学功能。最新的实验证据显示,牙齿组织中有氯离子通道存在,某些氯离子通道基因敲除小鼠模型(CFTR和ClC-5)出现了明显的牙齿结构和形态异常。ClC-7是电压门控氯离子通道家族的一个成员,在体内广泛存在。研究表明ClC-7与某些骨遗传性疾病密切相关,人们在研究Clcn7-/-小鼠的过程中发现,Clcn7-/-小鼠表现出严重的视网膜变性和骨硬化症等症状,并伴有牙齿不萌出的现象,同时在婴儿骨硬化患者中也发现了CLCN7基因的突变型。结合氯离子通道特别是ClC-7的生理功能和牙胚发育的自身特点,以及牙齿和骨在组织结构上具有的相似性,我们提出这样的假设:ClC-7可能参与了牙齿的发育过程。本课题采用免疫组织学、原位杂交、RT-PCR和细胞培养等技术进行了以下三个部分的实验研究: 第一部分ClC-7在小鼠牙胚中的表达研究本部分首先应用RT-PCR方法证实出生1d的小鼠牙胚中有Clcn7的表达,然后应用免疫荧光技术来确定小鼠牙胚中ClC-7蛋白表达分布模式和原位杂交的方法观察Clcn7 mRNA在小鼠牙胚中的表达。ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在小鼠钟状期牙胚中广泛表达。小鼠磨牙牙胚钟状早期,内釉上皮层细胞、中间层细胞、星网状层细胞、牙乳头细胞都有ClC-7阳性表达,内釉上皮层呈强阳性表达;小鼠磨牙牙胚钟状晚期,ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在成釉细胞、成牙本质细胞中存在阳性表达,同时在牙乳头细胞、星网状层细胞也呈阳性表达。这些实验结果说明电压门控氯离子通道ClC-7可能在牙齿发育过程中具有一定的调控作用,可能参与了成牙本质细胞、成釉细胞的生理过程。第二部分ClC-7在牙齿相关细胞中的表达研究本部分实验采用RT-PCR和免疫组织化学方法检测了Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白在体外培养的成釉细胞样细胞LS8、成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达情况。结果表明,成釉细胞样细胞LS8、成牙本质细胞样细胞MDPC-23中都有Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白的表达,两种细胞中Clcn7 mRNA表达水平没有显著差异,但成牙本质细胞样细胞MDPC-23中ClC-7蛋白表达水平要高于成釉细胞样细胞ClC-7蛋白表达水平。本部分结果揭示,成釉细胞样细胞LS8、成牙本质细胞样细胞MDPC-23可以做为进一步研究ClC-7参与牙齿发育调控机制的细胞模型,为今后研究ClC-7在成釉细胞、成牙本质细胞中的生理作用提供了实验基础。第三部分ClC-7在牙乳头细胞分化中的作用研究本部分采用原代细胞培养技术,体外培养小鼠牙乳头细胞,分为实验组和对照组,实验组同时加入终浓度为25ng/ml的M-CSF和终浓度为50ng/ml的RANKL诱导48h,对照组不加任何诱导因子,然后采用免疫荧光染色、原位杂交和RT-PCR的方法对实验组和对照组中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表达进行比较。实验结果表明,加入诱导因子M-CSF和RANKL的牙乳头细胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表达均高于对照组。本部分研究表明,M-CSF和RANKL可以提高ClC-7在牙乳头细胞中的表达水平,可能促进了牙乳头细胞的分化,但M-CSF和RANKL促进牙乳头细胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA水平升高的机制和途径有待于进一步研究,提示ClC-7可能参与了牙乳头的分化。综合以上实验结果,ClC-7在小鼠牙胚中有特异性空间表达,并且在体外培养的成釉细胞样细胞LS8、成牙本质细胞样细胞MDPC-23也有表达,ClC-7可能参与了牙齿的发育过程;经M-CSF和RANKL诱导的牙乳头细胞ClC-7表达水平升高,揭示ClC-7可能与牙乳头细胞的分化相关。
【图文】：

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-/-小鼠骨骼系统异常，，是由于其体内破骨细胞功能丧失，导致骨图1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠体形图2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X线片图3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的胫骨X线片图4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的胫骨切片-16-

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图1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠体形图2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X线片图3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的胫骨X线片图4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的胫骨切片-16-
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R78

【参考文献】