涎腺腺样囊性癌对神经雪旺氏细胞的破坏及其阻断

发布时间：2020-05-16 14:07

【摘要】：目的:雪旺氏细胞(Schwann cells, SCs)是包裹外周神经的胶质细胞,亦称神经膜细胞或鞘细胞。雪旺氏细胞包绕外周神经纤维束,构成有髓神经纤维,成为有髓神经的组成成份。 涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤,易于早期浸润神经。在临床上引起感觉异常、麻木和疼痛。以往认为肿瘤对神经的侵犯仅仅是一种占位,或“和平共处”,肿瘤不直接破坏神经本身。然而,肿瘤的嗜神经生长能否对神经造成直接破坏或侵蚀?目前尚不清楚。 SACC中的肿瘤性肌上皮细胞(neoplastic myoepithelial cells, NMCs)具有双向分化潜能,能够分泌产生蛋白多糖(proteoglycans, PGs)。PGs是由一种由核心蛋白连接氨基葡聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)所构成的大分子糖蛋白,提供肿瘤的细胞外间质,对于肿瘤的增殖、侵袭、分化和转移都具有重要作用。但是PG在SACC对神经的侵犯和破坏中是否具有作用?目前的研究报道较少。在细胞中,PG的生物合成是在木糖基转移酶( Xylosyltransferase , XT )催化下起始的。木糖基转移酶-I(Xylosyltransferase,XT-Ⅰ)催化的是PG合成中的效率-限制性阶段(rate-limited step),对于PG的生物合成至关重要。 目前应用广泛的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,是在细胞中导入与靶基因的mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA),使mRNA发生降解,导致基因表达沉默。 本研究体外培养人外周有髓神经雪旺氏细胞(Human Schwann cells, HSc),与SACC细胞共培养,观察SACC细胞对人神经雪旺氏细胞的侵袭及破坏情况。并应用RNAi技术抑制SACC细胞的PG分泌,观察PG阻抑前后SACC细胞对人神经雪旺氏细胞的侵袭和破坏作用。以探讨和证实(1)SACC细胞对人外周有髓神经雪旺氏细胞有无直接破坏?(2)PG在SACC细胞对人外周有髓神经雪旺氏细胞破坏中有无发挥作用? 方法: 1细胞培养:采用RPMI 1640培养液培养SACC-83细胞;用DMED:F12培养液原代培养人神经雪旺氏细胞(human Schwann cells)。并通过免疫细胞化学方法,应用细胞角蛋白和肌球蛋白单克隆抗体鉴定SACC-83,S-100蛋白单克隆抗体鉴定人神经雪旺氏细胞; 2细胞转染:将shRNA真核表达载体shRNA-WJ4(阻抑组)和shRNA-HK(阴性对照)通过脂质体转染SACC-83细胞,沉默其XT-Ⅰ基因的表达;未转染shRNA真核载体的SACC-83细胞(未转染组)作为对照。 3 XT-Ⅰ基因检测:采用Real-Time PCR技术,从mRNA水平检测RNAi后SACC-83细胞XT-Ⅰ基因的表达; 4 PG含量测定:应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默48h内SACC-83细胞PG合成分泌的改变; 5肿瘤侵袭性观察:将阻抑组SACC-83-WJ4细胞、对照组SACC-83-HK和未转染组SACC-83分别与在24孔板培养的人神经雪旺氏细胞混合培养24 h,在倒置荧光显微镜和扫描电镜(Scanning electron microscope, SEM)下进行观察,且对其进行固定后应用免疫组织化学染色,区分肿瘤细胞和人神经雪旺氏细胞以便于人神经雪旺氏细胞进行侵袭率的计数。 6统计学分析:所有实验数据采用SPSS 13.0统计分析软件进行方差分析,P0.01表示具有统计学意义。 结果: 1原代培养人神经雪旺氏细胞,进行S-100蛋白免疫细胞化学鉴定。人神经雪旺氏细胞胞浆呈棕褐色。SACC-83细胞对抗角蛋白CK和肌球蛋白myosin免疫细胞化学染色,细胞呈阳性表达。 2 shRNA-WJ4(阻抑组)、shRNA-HK(阴性对照)成功转染SACC-83细胞,转染后稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转染效率分别为51.44%、58.70%。SACC-83(未转染组)不显示荧光。 3基因转染48 h后,Real-Time PCR时实定量检测发现,shRNA-WJ4中XT-Ⅰ基因mRNA沉默效率为49%。 4基因转染后48 h培养液Blyscan Assay Kit检测发现,PG分泌降低。SACC-83-WJ4组PG合成抑制率为41.32%。 5光镜和扫描电镜观察发现,在SACC-83组中肿瘤细胞有聚集趋向,共同攻击人神经雪旺氏细胞;人神经雪旺氏细胞受到肿瘤细胞的直接侵袭和破坏后,细胞浆离散解体,胞核固缩。而阻抑PG分泌的SACC-83- WJ4组中的肿瘤细胞,远离人神经雪旺氏细胞,对雪旺氏细胞不产生侵蚀和破坏作用。 结论: 1人SACC细胞能直接浸润和破坏人外周神经。 2蛋白多糖在SACC细胞对人外周神经的破坏中发挥重要作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.8

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