体外磷灰石晶体矿化模型构建及应用的研究

发布时间：2020-05-26 08:54

【摘要】： 生物矿化是生物体内矿物形成过程的统称,是一个受到众多因素精密调控的生理过程。其研究涉及生物学、化学、结晶学、材料学、矿物学和医学等学科,是一门多学科共同推进的交叉前沿学科。生物体内矿化过程调控机制的研究在很大程度上依赖于体外矿化模型的构建和应用。目前应用较多的单分子膜模型和凝胶矿化模型由于自身的缺陷难以对生物体内硬组织矿化过程进行有效模拟。本研究拟利用具有离子选择透过性的阳离子膜和透析膜构建双膜体外矿化系统,并应用此模型对牙体硬组织生物矿化相关的无机因素、有机因素及无机/有机因素的协同作用进行研究,以期构建一个有效的生物矿化模型,对牙体组织中生物磷灰石晶体的矿化调控机制进行探讨。所取得的研究结果如下: 1体外矿化双膜系统的构建及检测利用阳离子膜和透析膜构建双膜系统,对系统的稳定性、可靠性进行了检测。结果表明,双膜系统在溶液环境中反应3日即可获得有效的矿化物晶体沉积,随着反应时间的延长,系统的失败率增加,但晶体成份及形态无显著变化。在系统内加入1ppm氟离子后,在阳离子膜表面形成了大量杆状氟磷灰石晶体;而加入含10%胎牛血清的培养基后,阳离子膜表面则形成了大量片层状晶体,晶体成份为磷酸八钙。通过对双膜系统矿化模型的改建,初步构建了稳定的矿化反应系统,并通过氟离子和含10%胎牛血清的培养基初步证实了双膜体外矿化模型的可靠性及有效性,为进一步的研究打下了基础。 2无机因素在体外对磷灰石晶体矿化作用的研究利用先前实验构建的双膜体外矿化模型对氟离子、镁离子及碳酸氢根离子在体外对磷灰石晶体矿化的作用进行研究。实验结果显示,不同浓度氟离子的加入对晶体的成份及形态均产生了影响。低浓度的氟即可对晶体形态产生显著作用,晶体由不规则的蠕虫状转变为具有一定排列方向的杆状晶体,成份也由磷酸八钙转化为磷酸八钙和氟磷灰石的混合物。氟离子浓度达到或超过5ppm后,大量杆状的氟磷灰石晶体优先在磷酸盐溶液中形成,而阳离子膜表面无明显晶体沉积。加入镁离子后,阳离子膜表面晶体沉积受到抑制,晶体结晶度降低,但晶体成份仍为磷酸八钙;碳酸氢根离子的加入则促进了磷酸八钙晶体的矿化,并且直接参与了晶体的构成。以上结果表明,低浓度的氟离子即可在磷酸八钙向羟基磷灰石的转化过程中发挥作用,并导致晶体形态的变化。镁离子则可能通过和钙离子的竞争作用抑制磷酸八钙晶体的生长,碳酸氢根离子促进磷酸八钙晶体的矿化,取代磷酸氢根离子,参与晶体的构成。其对局部矿化微环境pH值的影响作用也是其促进磷酸八钙晶体矿化的可能因素之一。无机因素在磷灰石晶体的成核、生长过程中发挥了重要的调控作用。 3有机因素在体外对磷灰石晶体矿化作用的研究利用双膜系统对单一组份有机大分子物质(牛血清白蛋白,提取的猪釉原蛋白片段及重组小鼠细胞外基质磷酸化糖蛋白),多组份有机混合物(大鼠牙髓细胞矿化诱导培养上清)在体外对磷灰石晶体矿化的影响进行研究。实验结果显示,在有机物的参与下,阳离子膜表面沉积的晶体主要成份均为磷酸八钙。在矿化相关蛋白组(釉原蛋白和细胞外基质磷酸化糖蛋白)中,形成了呈球状聚集的晶体团,而牛血清白蛋白组中则未发现这种现象。有机大分子的加入对晶体生长均产生了抑制作用。大鼠牙髓细胞矿化诱导后培养上清对磷酸八钙晶体形态作用明显,相对于对照组,形成了形态和排列更规则的片层状晶体。上述结果说明,相对于晶体的成份,有机大分子对晶体形态的影响作用更强。矿化相关蛋白可能直接参与生物磷灰石晶体的成核,并通过与晶体特定晶面的相互作用调控生物晶体的取向性生长。 4无机/有机因素共同作用对磷灰石晶体体外矿化的影响利用双膜系统对无机/有机因素共同作用对磷灰石晶体体外矿化作用的影响进行研究。分别检测了牛血清白蛋白和氟离子,及釉原蛋白和氟离子的共同作用对晶体矿化的影响。实验结果显示,无机/有机因素的协同作用对磷灰石晶体的形态及成份均产生了作用,当牛血清白蛋白与氟离子共同作用时,磷酸八钙晶体向另一种羟基磷灰石的前体物质磷酸氢钙转化,而当釉原蛋白和氟离子共同作用时,晶体则向磷灰石转化。这说明矿化相关的釉原蛋白可能通过参与成核及与特定晶面的相互作用,对特定晶体的生长有特异性的作用。综上所述,无机离子和有机大分子在磷灰石晶体的生物矿化过程中发挥着不同的调控作用。无机离子通过取代羟基磷灰石前体物质中的羟基(氟离子)、与钙离子竞争磷灰石晶体表面生长点(镁离子)等作用,改变晶体的热力学稳定性,从而影响矿化物的成份。而有机大分子则通过参与成核及其功能基团与生长中晶体特定晶面的结合,调控晶体的形态。此外,釉原蛋白和细胞外基质磷酸化糖蛋白有可能直接参与了晶体的成核。有机/无机因素的协同作用则是生物矿化物成份和形态的决定因素。
【图文】：

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-33-图 1.1 双膜系统构建示意图束后，去离子水轻柔冲洗阳离子膜及表面矿物，70°描电镜（SEM）对膜表面的矿化物进行形态观察；晶上随机挑选 30 个测量点进行测量；将晶体从阳离子洗，充分干燥后 X 线衍射法（XRD）及能谱分析（统在 3 天后均保持完好（12/12）, 7 天后 83%（10/1侧封口膜脱落，导致透析膜脱落。10 天后 50%（6/

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第四军医大学博士学位论文败模型均系离心管外固定透析膜的封口膜脱落，导致反应空间开放，模型失败。模型最长维持时间为 14 日。反应 3 天、7 天、10 天后，阳离子膜表面均有少量晶体沉积，但晶体量并没有显著增加。透析膜表面则无明显晶体沉积。SEM 结果显示，阳离子膜表面沉积有大量形态相似，尺寸均一排列无明显取向性的蠕虫状矿化物，随反应时间的延长，，阳离子膜表面无定形矿化物量增加（图 1.1）。蠕虫状晶体长度为 0.82±0.24μm。XRD 检测显示，3、7、10 天后，沉积物主要成份均为磷酸八钙（OCP）（图 1.2），能谱分析结果显示，矿化沉积物平均 Ca/P 为 1.313（n=6），接近 OCP 的 1.33。FTIR 结果中，1113，1029，964，601，563cm-1处出现了 PO43-的非对称伸缩振动峰，916cm-1处的振动峰表明 HPO42-基团的存在，说明沉积物成份为 OCP（图 1.3）。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78

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