BMP9基因敲除鼠牙—牙槽骨复合体发育缺陷的相关研究

发布时间：2020-05-28 08:51

【摘要】：背景:牙齿的发育是由外胚层来源的上皮细胞和神经嵴来源的间充质细胞相互作用实现的。大量的信号通路及相关的信号分子参与调控牙齿发育的过程,比如骨形态发生蛋白分子(bone morphogenetic proteins,BMPs)。在目前已分离出来的14种骨形态发生蛋白中,骨形态发生蛋9(BMP9),也称为生长转化因子2(growth and development 2,GDF2)是诱导间充质干细胞成骨分化能力最强的一种BMP分子,但BMP9在牙齿发育过程中的作用尚不清楚。目的:本实验的目的是探究BMP9信号在牙齿发育过程中的作用并初步探讨BMP9影响牙齿发育的可能机制。方法:本实验第一部分通过免疫组化染色研究BMP9在小鼠牙胚中的表达模式。第二部分实验利用已成功构建的BMP9基因敲除小鼠模型通过大体观察、micro-CT、三维重建分析以及组织学分析研究BMP9对牙-牙槽骨发育的影响。最后在体外实验中,利用沉默表达和过表达BMP9的腺病毒感染小鼠根尖牙乳头干细胞后进行ALP染色、ALP活性分型和qPCR来观察对其成骨、成牙分化能力的影响。结果:实验第一部分,通过对不同发育阶段的小鼠磨牙牙胚进行免疫组化染色,我们发现BMP9在牙冠和牙根发育时期的成牙本质细胞,成釉细胞,牙髓细胞,牙槽骨的成骨细胞中均有表达。实验第二部分,通过大体形态研究发现BMP9基因敲除小鼠的牙齿比对照组野生型小鼠更易磨损,且牙根较短。通过micro-CT、三维重建和组织学分析发现与野生型小鼠相比,BMP9基因敲除小鼠第一磨牙的牙根短,牙本质壁薄,根管和根尖孔粗大,这些现象与人类遗传性疾病--Ⅲ型牙本质发育不全相似。此外,BMP9基因敲除小鼠牙槽嵴变低,牙槽骨骨密度降低,骨体积分数减小。体外实验证明沉默表达BMP9可以抑制牙源性干细胞的成骨分化标志物ALP和成牙分化标志物牙本质涎磷蛋白(Dspp)、牙本质基质蛋白1(Dmp1)的表达,而过表达BMP9则会促进ALP、Dspp和Dmp1的表达。结论:BMP9可能在牙齿-牙槽骨复合体的发育中有重要作用,但其具体机制还需进一步研究。
【图文】：

下颌第一磨牙,出生后,免疫组化染色,小鼠

图 1.1 (A-D)出生后 4,7,11,15 天小鼠下颌第一磨牙的 HE 染色。(A’-D’)A-D 的放大图像。Od,成牙本质细胞;Am, 成釉细胞; P, 牙髓细胞; Os, 成骨细胞.比例尺：500μm or 50μm。Figure 1.1 (A-D) H & E staining of first mandibular molar in mice at PN4, PN7, PN11 andPN15. (A’-D’) Magnification ofA-D. Od, odontoblasts; Am, ameloblasts; P, dental pulp; Os,osteoblasts. Scale bars: 500 μm or 50 μm.2.2 免疫组化染色结果根据 H&E 染色的结果，我们选择了 PN4,7,11,15 来代表出生后牙齿发育的几个重要阶段以探究 BMP9 在出生后牙胚发育过程中的表达模式。如图 1.2 所示，在PN4 时，BMP9 在成釉细胞，成牙本质细胞中表达。除此之外，BMP9 在牙囊细胞，，牙髓细胞，牙槽骨的成骨细胞，以及牙釉质基质和前期牙本质中均有表达。在PN7，PN11 和 PN15 时，BMP9 在牙胚中的表达模式与 PN4 时相似。本实验用 PBS 代替BMP9 一抗作为阴性对照组。

形态图,基因敲除,形态,切牙

图 2.1 BMP9 基因敲除鼠牙齿的大体形态。（A）BMP9 基因敲除鼠基因构建示意图。(B)BMP9 基因敲除鼠切牙切端明显磨耗，而对照组正常小鼠切牙是完整的。白色箭头指示切牙。 (C) BMP9 基因敲除鼠下颌第一磨牙牙尖明显磨耗并且牙根比对照组正常小鼠短。红色箭头指示牙尖。Figure 2.1 Gross morphology of teeth in the BMP9-KO mice. (A) Gene targeting strategy forgenerating BMP9-KO mice. (B) Representative images of tooth morphology of the BMP9-KOand wild-type mice. The incisor tip was worn in BMP9-KO mice, which was intact in wild-typecontrol (white arrows). (C) The first mandibular molar from BMP9-KO mutants vs. wild-typelittermates. The BMP9-KO mice displayed smaller molar with shorter roots and obvious worncusps compared with wild-type. Red arrows indicated the molar cusps.2.2 Micro-CT 分析 BMP9 基因敲除鼠和对照组野生型小鼠牙及牙
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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