滇蓝尾蝾螈前肢及下颌骨再生组织nAG蛋白基因表达分析

发布时间：2020-05-30 18:42

【摘要】：[目的]利用云南省特有的动物资源,以滇蓝尾蝾螈(Cynops cynaurus)作为研究对象,探索蝾螈前梯度蛋白(newt Anterior gradient, nAG)在滇蓝尾蝾螈下颌骨及前肢再生过程中的表达特点。 [方法]取成年野生型滇蓝尾蝾螈共60条,雌雄各半,随机分为两组,每组30只,在三卡因麻醉下分别截除下颌骨正中1/3及左前肢肘关节以下部分,术后定时大体观察蝾螈生存及组织再生情况,5天、12天时各处死每组15只蝾螈,按组别切取下颌骨、左前肢再生组织以及相对应动物右前肢、下颌骨的正常组织为对照,通过RT-PCR技术获取nAG蛋白编码基因,直接测序,与GeneBank中公认序列进行比对,检测再生组织中是否存在nAG蛋白；同时应用原位杂交技术检测下颌骨及肢体再生过程中不同时间点nAG蛋白的表达及分布情况。使用HPIAS-1000软件分析原位杂交石蜡切片中nAG蛋白的表达浓度并计算nAG蛋白阳性表达率。利用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析。 [结果]所有实验动物术后均健康成活,被切除的下颌骨和肢体在取材时间点已实现部分再生。具体过程如下：截除术后1小时,创口止血完成,口底组织收缩,使下颌骨两断端相对靠拢,前肢残端创口则轴向聚拢；术后3天,创口表面光滑,已有创面上皮(wound epidermis, WE)覆盖；术后5天,上皮顶帽(apical ectodermal ridge, AEC)形成；术后7天,上皮顶帽增厚；术后12天,截断面出现透明小突起,形成明确胚芽(blastma, BL)。通过对滇蓝尾蝾螈再生组织提取总RNA,利用RT-PCR技术获取的nAG蛋白基因片段大小及序列证实与目的基因序列一致。原位杂交结果显示,在整个下颌骨及肢体再生过程中,表皮的基底细胞及神经纤维都有nAG蛋白的阳性表达,并且在再生过程中不同部位、不同时间点,阳性表达的区域各不相同。nAG蛋白在术后5天顶帽下方软骨(骨)组织和间充质细胞内表达,神经组织也有表达,术后12天在表皮的基底细胞内表达。nAG蛋白阳性表达率在不同时间不同组织、相同时间不同组织及相同组织不同时间表达有差异性(P0.05)。 [结论]1.成体滇蓝尾蝾螈具有再生下颌骨和肢体的能力,其再生方式为割处再生；2.成体滇蓝尾蝾螈可作为下颌骨再生研究的理想动物模型；3.成体滇蓝尾蝾螈下颌骨及肢体再生过程中都有nAG蛋白的阳性表达,经RT-PCR实验扩增的nAG蛋白基因片段与目的蛋白基因序列一致,证实再生组织内有nAG蛋白的表达；4.nAG蛋白与蝾螈下颌骨及肢体再生密切相关,成体滇蓝尾蝾螈下颌骨及肢体再生过程中都有nAG蛋白的阳性表达；5.nAG蛋白与蝾螈下颌骨及肢体再生密切相关,且其表达部位与再生时间有关。在蝾螈肢体和下颌骨再生过程中,nAG蛋白在蝾螈的再生组织中随着时间的改变,在不同的组织中阳性表达的强度也会发生相应改变。术后5天,nAG蛋白主要表达在神经纤维及间充质细胞内；术后12天,nAG蛋白主要表达在AEC和其下方的去分化细胞内；6.nAG蛋白只出现在下颌骨及前肢再生时期处于增殖状态的细胞中,其阳性表达在细胞的增殖与分化中发挥着重要作用,一旦细胞分化成熟后即表达阴性。提示nAG蛋白可以作为反映再生下颌骨及肢体再生中细胞增殖分化的重要指征；7.nAG蛋白是一种细胞增生和分化因子,是否为启动因子及是否也存在于高等级哺乳动物还需要进一步研究。
【图文】：

滇蓝尾嵘蜕

照片,肢体,术前

所有滇蓝尾嵘螺下领骨部分截除及左前肢截断术后均存活。通过观察发现，实验动物均能再生下领骨及左前肢，局部无感染坏死等并发症。1.术前照片(图1一l):正常下领骨及前肢，依红线部位截除组织。图1一1术前正常下颇骨及肢体2.术后当天(图1一2):截除术后1小时，创口止血完成，在周围肌肉的牵拉下，下领骨断端相对靠拢，损伤的细胞碎屑和凝结的血块构成伤口的临时覆盖;肢体创口周围组织缺乏骨组织的支持，残端在局部软组织的作用下向创口聚拢，，周围皮肤边缘出现了轻微的皱缩。图l一2术后当天残余下领骨在口底组织作用下向创口轻微靠拢，前肢残端创口轴向聚拢红色箭头所示为缺损部位3.术后3天(图1一3):截断面光滑无渗血、感染，可观察到创口皮肤收缩，断面被一薄层上皮组织覆盖，呈半透明状，创口上皮 (woundePidermis
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R782.2

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