小鼠EPM纤毛IFT88与Shh信号表达及纤毛解体关系的研究

发布时间：2020-05-31 14:39

【摘要】：目的:敲减小鼠腭胚突间充质(Embryonic Palatal Mesenchymal,EPM)细胞初级纤毛内运输系统(Intraflagellar transport,IFT)相关重要组件Ift88,探讨EPM细胞初级纤毛与Sonic Hedgehog(Shh)信号传递之间的关系及IFT88在纤毛解体中的作用。方法:体外培养胚胎13.5天C57BL/6J小鼠EPM细胞并鉴定,将培育细胞分为三组,实验组细胞慢病毒转染敲减Ift88,空白对照组细胞常规培养,阴性对照组细胞转染空载慢病毒培养。实验1:上述三组细胞加入分泌性Shh蛋白培养24小时后提取总蛋白,利用免疫印迹技术检测对比三组细胞Shh信号通路相关因子Ptch1、Smo、Gli3、Cyclin D1,并比较转录因子Gli3A/Gli3R的比率变化;同时对比三组细胞纤毛解体相关蛋白Aurora A、磷酸化Aurora A和HEF1的变化;实验2:实验组细胞分成两组分别不加分泌性Shh蛋白(实验A组)和加入分泌性Shh蛋白(实验B组),检测对比Gli3A/Gli3R比率变化及Cyclin D1表达的变化,进行统计学分析。结果:实验1:Smo与Ptch1表达量在实验组和空白对照组中比较无统计学差异。Gli3A/Gli3R比率在实验组较空白对照组升高(P0.05),Cyclin D1在实验组与空白对照组相比表达增加(P0.05);HEF1实验组与空白对照组相比表达减少(P0.05),Aurora A实验组与空白对照组相比表达明显减少(P0.05),磷酸化Aurora A实验组与空白对照组及阴性对照组相比无统计学差异;实验2:实验A组与实验B组比较,实验B组Cyclin D1表达和Gli3A/Gli3R比率均升高(P0.05)。结论:敲减Ift88后影响Shh信号通路相关组件和纤毛解体相关蛋白的表达,Shh信号在小鼠EPM细胞中可能通过非依赖于初级纤毛的通路传递其下游信号因子,同时IFT88影响纤毛调控器HEF1及Aurora A进而影响纤毛的稳定性。
【图文】：

突间充质细胞的培养娠 13.5 天(Embryo Day, ED13.5)的孕鼠实施安死术后，使用 75%酒下取出胚胎，分离获取腭突，如图 1,2 所示。将离体腭突放入装有 4%2 ml EP 管中，4 ℃冰箱过夜消化 18-24 h，在体视显微镜下使用显微腭突间充质，1000 rpm/min 低速离心 5 min，弃上清，，将含有 0.25%EDTA 混合消化液加入 EP 管中，吸管反复萃打间充质，消化为单细％胎牛血清的 DMEM/F121:1 完全培养基终止消化，1000 rpm 低速离，加入含10％胎牛血清的DMEM/F121:1完全培养基重悬细胞，以5接种到 T25 ml 细胞培养瓶中，补充培养基到 2.5 ml，移至 5％ CO胞培养箱中继续培养。隔天半量换液，倒置相差显微镜观察细胞生示。待细胞增殖铺满瓶底后用胰酶消化，1:3 比例传代。细胞生长续试验[25]。

图 2 ED13.5 小鼠胚胎腭板形态(50×)(A) 腭板形态 (B) 腭板剪切后形态Fig.2 Palatal Shelves Morphology of Mouse ED13.5(50×)(A) Palatal Shelves Morphology (B) Posterior Shape of Palatal Shelves after Shearin图 3 腭胚突间充质细胞培养 24 h(20×)Fig.3 Embryonic Palatal Mesenchymal Cells Cultured for 24 h(20×)
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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本文编号：2690010