PD-1维持人牙髓间充质干细胞生物学性能及相关调控机制的研究

发布时间：2020-05-31 19:10

【摘要】：目的:间充质干细胞广泛存在于人体多种器官组织中,包括骨髓、脐带、脂肪组织、肌肉组织以及牙源性组织等。牙髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell from dental pulp,MSC-DP)分离提取于脱落乳牙或成熟恒牙的牙髓组织,是一种独特的胚胎神经嵴源性的成体干细胞群。MSC-DP具有比经典骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)更强的自我更新能力;体外诱导培养能够分化为成骨/成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及更强神经细胞分化潜能,在体内能够形成独特的牙髓牙本质样组织;同时MSC-DP具有优越的免疫调节性能,能够有效调节CD4+辅助性T细胞、调节性T细胞等多种免疫细胞功能,从而治疗自身免疫性疾病。MSC-DP因其来源丰富、获取容易以及独特优秀的生物学性能,成为干细胞治疗中极具应用前景的干细胞源,但其生物学性能的调控机制尚不清楚。程序性细胞死亡蛋白l(programmed cell death protein 1,PD-1)是一种免疫抑制性受体,表达于活化T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞。PD-1受其配体激活后,通过抑制CD4+辅助性T细胞的早期活化调控T细胞应答,从而引起机体免疫耐受。此外,PD-1在肿瘤免疫中亦发挥关键作用,通过诱导CD8+T细胞凋亡,并抑制其生物学功能,从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。以PD-1信号为靶点是现代免疫性疾病和抗肿瘤免疫治疗中极具应用前景的代表性治疗方法。然而,学者通常认为“细胞凋亡相关受体蛋白”PD-1并不表达于间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其是否调控干细胞功能更未见相关研究。本课题旨在研究PD-1对干细胞生物学性能,特别是对人牙髓间充质干细胞性能的调控作用及其具体分子机制,为揭示MSC-DP生物学性能的调控机制和PD-1在干细胞领域的生物学功能奠定理论依据和实验基础。研究方法:1、体外分离培养人BMMSCs和胚胎神经嵴来源的人MSC-DP,后者包括脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)、牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)。2、应用 Western blot、qPCR、免疫荧光染色、流式细胞术等检测BMMSCs和MSC-DP中PD-1的表达情况。3、通过siRNA沉默技术调控PD-1的表达水平、流式细胞分选技术筛选PD-1阳性/阴性细胞群,研究PD-1在BMMSCs和MSC-DP干细胞生物学性能中的调控作用。4、通过siRNA沉默技术、化学抑制剂等方式调控PD-1的表达水平、CRISPR/Cas9技术制备PD-1基因敲除的MSC-DP,探索PD-1调控MSC-DP干细胞生物学性能的具体分子机制。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析,P0.05为差异具有统计学意义。研究结果:1、PD-1在MSC-DP的细胞膜上呈持续性表达,而BMMSCs不表达PD-1;PD-1与多种干细胞表面标记物共表达于MSC-DP和人牙髓组织,流式细胞术检测显示PD-1+/CD73+双阳性细胞比率为16.76%、PD-1+/CD90+双阳性细胞比率为17.55%、PD-1+/CD105+双阳性细胞比率为11.86%;且PD-1表达水平随MSC-DP传代扩增而降低。2、siPD-1沉默MSC-DP的PD-1表达,MSC-DP的增殖率、细胞群倍增次数以及S/G2/M期比例明显下降(P0.05),而MSC-DP成骨/成牙本质向和成神经向分化能力明显提高(P0.001);与PD-1-MSC-DP相比,PD-1+MSC-DP具有显著升高的细胞增殖率、细胞群体倍增次数以及S/G2/M期比例(P0.001),同时具有显著降低的成骨/成牙本质向和成神经向分化能力(P0.001)。siPD-1转染处理对BMMSCs生物学性能无明显调控作用。3、MSC-DP通过PD-1及下游SHP2/ERK/Notch信号通路调控其增殖率、细胞群体倍增次数,从而促进其自我更新;通过PD-1及下游SHP2/ERK/β-catenin信号通路调控其钙结节形成能力和成骨蛋白表达水平,从而抑制成骨/成牙本质向分化。结论:1、胚胎神经嵴来源的MSC-DP稳定表达细胞膜蛋白PD-1,PD-1可作为一种新的牙源性干细胞表面标记物。2、PD-1能够促进MSC-DP自我更新能力,抑制其多向分化潜能,是维持MSC-DP生物学性能的关键因素。3、PD-1通过SHP2/ERK/Notch信号通路调控MSC-DP增殖;通过SHP2/ERK/β-catenin信号通路调控MSC-DP成骨/成牙本质向分化。
【图文】：

为探宄ＰＤ－１及其配体ＰＤ－Ｌ１是否在ＢＭＭＳＣｓ和ＭＳＣ－ＤＰ表达，，我们体外分逡逑离培养了人ＢＭＭＳＣｓ和人ＭＳＣ－ＤＰ，后者包括ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ，检测ＢＭＭＳＣｓ、逡逑ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ的ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１表达水平。ｑＰＣＲ结果显示ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ表达逡逑尸／）－７，而ＢＭＭＳＣｓ不表达且＿与ＤＰＳＣｓ相比，ＳＨＥＤ具有较高ＰＺ）－７塞想表逡逑达水平邋ＣＰ＜０．０１）（图邋３．１邋Ａ）。ＢＭＭＳＣｓ、ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋均表达尸黑％邋ＳＨＥＤ逡逑和ＤＰＳＣｓ相比，ＢＭＭＳＣｓ具有较高．ｆ／ＷＪ表这水ｆ邋（Ｔ＜邋０．０１）（图３．１邋Ａ）。进』逡逑步邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋检测邋ＢＭＭＳＣｓ、ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋的邋ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１邋蛋白表达水平，逡逑结果与ｑＰＣＲ检测结果一致ＢＰ邋ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ表达ＰＤ－１，而ＢＭＭＳＣｓ不表达逡逑ＰＤ－１；簋与ＤＰＳＣｓ相比，ＳＨＥＤ具有较高．ＰＤ－１蛋白表达水乎（图３．１邋Ｂ邋）邋ｃＢＭＭＳＣｓ、逡逑ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ均表达ＰＤ－Ｌ１１且与ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ相比，ＢＭＭＳＣｓ具有较高ＰＤ－Ｌ１逡逑蛋白表达水平（图３．１邋Ｂ）。此外，ＰＤ－１蛋白表达水平随着ＳＨＥＤ细胞传代而明Ｍ降逡逑低（圈３．１邋Ｃ）。上述研究结果表明，ＰＤ－１仅表达于ＭＳＣ－ＤＰ，而不表达于ＢＭＭＳＣｓ；逡逑ＰＤ－Ｌ１在ＢＭＭＳＣｓ和ＭＳＣ－ＤＰ均有表达。逡逑

逦＾ｍｍｒｎｒｎ＾ｍｍ邋３３ＫＤ逡逑■逦Ｐ－ａｃｔｉｎ逦４３ＫＤ逡逑图３．２邋ＰＤ－１在ＭＳＣ－ＤＰ的表达定位逡逑（Ａ）兔愈kr灄Ｓ＾ＰＤ－１逦和邋ＰＤ－Ｌ１邋：粗邋ＢＭＭＳＣｓ、．邋ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋＿＿＾ｆｆｃ逡逑（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋检铡Ｓ＃邋ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋胞佭蛋白慕达邋ＰＤ－１，ＢＭＭＳＣｓ邋事赢达邋ＰＤ－１；邋ＳＨＥＤ、逡逑ＤＰＳＣｓ邋和邋ＢＭＭＳＣｓ邋胞桯＿邋白邋＿４邋ＰＤ－Ｌ１？邋：j⒊撸唬玻板澹蹂澹礤义

本文编号：2690329