LPS引起口腔颌面部感染的实验研究及其免疫炎症因子的测定

发布时间：2020-06-02 03:17

【摘要】：背景:口腔感染一直以来都被人们忽视。口腔颌面部的神经血管存在于充满蜂窝组织的间隙内,并在间隙中穿行,感染便由近及远在各间隙内扩散,形成多间隙感染。口腔颌面间隙感染的患者,初期略感面部不适,相应间隙受到累及后,会出现明显的炎症反应,皮肤发红,面部肿胀,触诊热,有自发痛和触痛,脓肿形成后会出现明显的波动感。主要通过牙源性和腺源性感染导致牙齿疾病、颌面部腺体疾病、牙周感染或普通溃疡等一些轻度疾病。如果在早期没有得到有效的治疗,致使引发颌面部相关组织的感染,便会并发颌面部蜂窝织炎、下颌骨骨髓炎等甚至全身性的感染,严重者甚至会造成生命危险。早期炎症能够激活免疫细胞并释放肿瘤坏死因子α,启动了抗炎反应。免疫细胞根据接收到不同微环境所传达的信号,可发生炎症或其他免疫调节等。如若接收到炎症信号,感染将进一步扩散到全身,全身炎症反应会释放大量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、颗粒酶、白细胞介素1(IL-1)、氧自由基等促炎因子和介质,造成淋巴细胞、树突细胞的快速凋亡及中性粒细胞延缓凋亡,导致免疫抑制。在炎症反应中,TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)是较为典型的炎症因子。其增加会促进炎症细胞的招募和聚集,加重炎症反应。目的:利用细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠结缔组织成纤维细胞L929及小鼠巨噬细胞RAW264.7,建立体外口腔颌面部细菌感染及免疫应答模型,检测不同时间点炎症因子的表达情况。LPS感染C57BL/6小鼠磨牙后区所对应的颌面部位置,建立体内口腔颌面部细菌感染体内模型,并检测相应时间点炎症因子的表达情况。方法:利用10、20、30、40、50、60μg/ml的LPS分别刺激L929及RAW264.7细胞,采用CCK-8法测定LPS对细胞增殖的影响。Q-PCR检测肿瘤坏死因子TNF-α、细胞炎症因子、趋化因子等相关基因的表达变化情况。ELISA检测细胞上清液中IL-6水平变化。70只C57BL/6小鼠根据LPS给药浓度的不同分为7组:实验A组(给予LPS 5μg/ml)、实验B组(给予LPS 10μg/ml)、实验C组(给予LPS15μg/ml)、实验对照D组(给予A组相同量的生理盐水)、实验对照E组(给予B组相同量的生理盐水)、实验对照F组(给予C组相同量的生理盐水)、正常对照组G组(对小鼠颌面部不做任何处理,其他同实验组小鼠)。根据每组不同处理将药物注射于约小鼠磨牙后区所对应的颌面部位置。分别在3,6,12,24,48,72h对小鼠活动状态及颌面部进行观察。并于72h处死小鼠,取感染部位组织进行HE染色,取血清进行ELISA检测。结果:CCK-8结果显示,L929细胞在LPS刺激24h,浓度小于20μg/ml时,细胞增殖率显著上升(P0.01);而随着浓度的增加(30-50μg/ml),细胞增殖率开始下降;浓度到达50μg/ml时,细胞增殖趋于平稳。RAW264.7细胞在LPS刺激24h,浓度小于50μg/ml时,细胞增殖率显著上升(P0.01);而大于50μg/ml时,细胞增殖率有所回落。QPCR实验结果显示TNF-α,IL-1,IL-5,IL-6,IL-8,IL-33的mRNA表达明显升高,而IL-10,IL-13,IL-23表达明显下降。CXCL2,CXCL10,FOXO3,GDF15表达量显著增加。ELISA结果显示50μg/m L LPS刺激24h、48h,L929细胞分泌IL-6含量分别为42.04pg/ml、45.52pg/mL;RAW264.7细胞分泌IL-6含量为25.90pg/ml,28.92pg/ml。100μg/ml LPS刺激24h、48h,L929细胞分泌IL-6的含量为18.97pg/ml、21.29pg/ml;RAW264.7细胞分泌IL-6含量为16.90pg/ml,18.21pg/ml。在LPS感染C57BL/6小鼠颌面部的体内实验中,当LPS注入4h开始,小鼠便出现行动缓慢,触碰反应迟钝。72h后,实验组体重平均下降了4±1g,小鼠出现摄食下降、排泄物粘结在肛门附近、悬尾无明显反抗、行动迟缓等抑郁行为。从感染部位纤维结缔组织、唾液腺组织、肌肉组织均发生病理改变,出现大量的炎性细胞浸润,发生了炎症相应的组织萎缩、液化、变性、坏死、纤维化。ELISA检测结果显示,血清中炎症因子IL-6含量从0.419444pg/ml上升到62.62851pg/ml(5μg/ml),TNF-α的含量从0.322800pg/ml升到9.520406pg/ml,而在LPS浓度为15μg/ml时,IL-6和TNF-α的含量分别为24.8694pg/ml、7.56178pg/ml(10μg/ml),分别降低了37.75914pg/ml、1.928626pg/ml。结论:1.不同浓度的LPS刺激L929细胞,在短时间作用(≤12h)下对细胞的生长起持续抑制作用。2.LPS刺激L929细胞24h,随着浓度的增加,细胞增殖率逐渐上升,到LPS浓度为30μg/ml时,增值率开始下降,说明LPS能够引起细胞增长,然而高浓度则会抑制细胞的生长。3.相同时间内,LPS浓度的增加对RAW细胞增殖无显著影响。在相同浓度下,LPS在短时间作用下(≤12h)能够促进RAW细胞增殖。4.LPS刺激24h,浓度大于50μg/ml时,细胞增殖率有所回落,说明长时间LPS的刺激能够引起RAW细胞明显增长而高浓度对细胞生长有抑制作用。5.LPS刺激L929及RAW264.7细胞能够引起细胞发生炎症反应,相关炎症因子及趋化因子的表达增加,证明成功建立了口腔颌面部感染体外模型。6.LPS感染C57BL/6小鼠能够引起口腔颌面部组织内发生炎症反应,其纤维结缔组织、唾液腺组织、肌肉组织均发生了组织液化、变性、纤维化、萎缩、坏死等病理改变。而血清中IL-6和TNF-α的表达也明显增加,证明成功建立了口腔颌面部感染体内模型。
【图文】：

实验结果,点对,波长,细胞

第 3 章实验结果第 3 章实验结果3.1 体外口腔颌面部感染实验3.1.1 CCK-8 检测不同浓度 LPS 对细胞的增殖的影响。为了探讨不同浓度LPS在不同时间点对于细胞增殖的影响，，我们通过CCK-8实验在 6，12，24h 分别检测了不同浓度 LPS（0-60μg/ml）作用下 L929 和RAW264.7 细胞增殖情况。两种细胞在 450nm 波长下的吸光度值，如图 1 所示:

细胞活力,活力,细胞生长

第 3 章实验结果细胞增殖率升高。而 LPS 浓度增加对于细胞增殖无显著影响。不同浓度 LPS 刺激 12h 细胞生长的曲线变化与 6h 相似，说明在短时间内 LPS 能够促进细胞增殖。当 LPS 刺激 24h，浓度小于 50μg/ml 时，细胞增殖率显著上升（P<0.01）；而大于 50μg/ml 时，细胞增殖率有所回落，说明长时间 LPS 刺激能够引起细胞明显增长而高浓度对细胞生长有抑制作用（图 1B）。3.1.2 CCK-8 检测不同浓度 LPS 对细胞活力的影响。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R782.3

【参考文献】