融合肽minTBP-1-PRGDN涂层影响钛表面成骨细胞粘附、增殖及分化功能的体外研究

发布时间：2020-06-06 05:33

【摘要】：金属钛因其良好的耐腐蚀性、生物相容性和骨整合性,在临床上已广泛用作于牙科修复种植体、正畸支抗种植体或人工关节。钛种植体稳定性是其植入成功的关键,多种活性肽和蛋白已被用于修饰钛种植体表面,以促进骨与种植体之间的达到稳定的骨性整合。RGD (Arg-Gly-Asp)肽作为大部分细胞外基质蛋白(包括一些矿化相关蛋白)的共有序列,是目前最有效和应用广泛和的促进生物材料表面细胞粘附的肽,而如何将肽固定于生物材料的表面是提高细胞粘附的前提。学者们试图借助于羟基、氨基或羧基等功能基团,将RGD通过共价结合的方式固定在生物材料的表面。然而,这些偶联方式存在一些缺点：除了复杂的处理过程外,偶联剂的毒性或者活性基团因水解而失活等现象均不容忽视。TBP-1 (RKLPDAPGMHTW)是一种新的从12肽噬菌体库中分离出来的肽适体,其具有与金属钛特异性相互作用的能力,其N端的RKLPDA (minTBP-1)序列是钛结合的重要位点。鉴于其对钛强大的特异性识别能力,minTBP-1常以与其他基序相结合形成融合肽,使得这些融合肽被赋予了同样的对钛特异性识别的能力。鉴于此,本研究合成一种含有RGD和minTBP-1序列的融合—RKLPDAPRGDN,探讨其与钛表面的相互作用；以及用该融合肽作为钛表面涂层,探讨对成骨细胞附着、伸展、增殖、分化及矿化功能方面的影响。第一部分融合肽minTBP-1-PRGDN与钛表面相互作用的研究目的探讨融合肽minTBP-1-PRGDN、minTBP-1及PRGDN在不同浓度时对钛亲和性的影响；氧化和未氧化钛表面对三种肽结合能力的影响；FITC标记对肽结合能力影响。方法实验一：钛片经顺序打磨、清洗、消毒备用,三种肽以不同浓度(1μg/ml,10μg/ml, 100μg/ml, 1000μg/ml)孵育钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。实验二：钛片经顺序打磨、清洗、一部分经30%硝酸氧化(另一部分不氧化)、消毒备用,XPS检测氧化与未氧化钛片表面元素成分；三种肽以100μg/ml浓度分别孵育氧化和未氧化的钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。实验三：钛片经顺序打磨、清洗、氧化、消毒备用,三种肽以100μg/ml浓度按照未标记与标记比例为0：1(None)、10:1、100:1分别孵育钛片过夜,双蒸水洗去未结合的肽。荧光显微镜拍照,IPP图像分析软件采集荧光照片的像素点、以平均每个钛片上的荧光像素点的数量作为结合到钛片表面的肽数量的间接反映。结果实验一：三种肽随着浓度的增加其结合到钛片上的数量均逐渐增加,100μg/ml时各种肽在钛片的结合接近饱和。实验二：经氧化后的钛片表面氧元素含量增加；minTBP-1-PRGDN和minTBP-1在氧化的钛片表面的结合数量增加,而PRGDN肽数昊减少。实验三：随着未标记肽掺入到标记肽中的比例增加,钛片表面荧光数量减少。第二部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞粘附的影响目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞附着数量、伸展形态及面积、粘附相关基因表达的影响。方法钛片经顺序打磨、清洗、氧化、消毒备用,三种肽以100μg/ml浓度孵育钛片表面过夜,未有肽孵育组作为空白对照；PBS洗去未结合的肽；成骨细胞在钛片表面生长一定时间后(实验四、五为1h,实验六为24h),PBS洗去未粘附细胞。实验四：Alamar Blue比色法检测附着细胞的数量;实验五：FITC-鬼笔环肽染色粘附细胞,荧光显微镜照相,IPP软件分析细胞伸展面积；实验六：RT-PCR荧光定量检测Integrinβ1和Cadherin-11基因表达。结果实验四：minTBP-1-PRGDN涂层钛片上附着的成骨细胞数量最多、PRGDN涂层组的细胞数量最少：实验五：minTBP-1-PRGDN融合肽涂层的钛片表面的成骨细胞伸展充分、面积最大,但细胞伪足少；PRGDN涂层的钛片表面成骨细胞伸展最不充分,多接近于立方形,伸展面积与其他各组相比也是最小；实验六：Integrinβ1和Cadherin-11基因表达量在PRGDN组均为最高。第三部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞增殖的影响目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞增殖数量、形态及相关基因表达的影响。方法实验七：MTT比色法检测四组成骨细胞在24h、48h、72h时的增殖数量；细胞经Giemsa's染色后金相显微镜观察在增殖72h时的形态；实验八：RT-PCR荧光定量检测Collagen la 1和Cyclin D1基因表达。结果实验七：各组细胞随时间延长数量逐渐增加,24h时minTBP-1-PRGDN涂层钛片表面的成骨细胞数量最多；72h时各组细胞大部分呈长梭形,伸展充分,并沿着钛片表面打磨的痕迹方向排列；实验八：cyclin D1:对照组外,其余各组表达量随时间延长而增加;达到72h时,minTBP-1-PRGDN组的cyclin D1表达量最大。CollagenⅠα1：各组表达量随时间延长降低后又有所增高；24 h时,PRGDN组的表达量最高；48h时,空白对照组表达量最低；72h时,minTBP-1组表达量最高。第四部分融合肽minTBP-1-PRGDN对成骨细胞分化及功能的影响目的探讨不同肽涂层的钛表面对成骨细胞分化过程中ALP酶活性、矿化相关基因表达、矿化结节形成数量及面积大小的影响。方法实验九：PNPP法检测成骨细胞诱导分化第3,7,10,14,21,28d时的ALP酶活性;实验十：RT-PCR荧光定量检测ALP、OPN、BSP、OC基因表达；实验十一：细胞诱导矿化28d后,茜素红染色矿化结节,金相显微镜照相,IPP软件分析各组结节数量及平均面积。结果实验九：各组成骨细胞诱导3-10d内,ALP活性值缓慢递增,从14d开始,ALP量的增加开始加速,28d时达到峰值；实验十：minTBP-1-PRGDN涂层表面成骨细胞分泌的OPN、OC、BSP及ALP四种基因的表达趋势均为：随着时间的延长,表达量先上升后降低,且在第14天时达到高峰。而minTBP-1涂层表面成骨细胞分泌的这四种基因的表达趋势均为随着时间的延长,表达量逐渐上升。空白对照组中,除了OC表达先降低后增高以外,其余三种基因的表达均为逐渐升高。而PRGDN组中除了BSP的表达先增加后减少外,其他三种基因的表达均为先降低升高。四种基因在第7d时,PRGDN组的表达均为最高；第14d时minTBP-1-PRGDN组表达量最高；实验十一：minTBP-1-PRGDN组的结节面积最大而minTBP-1组的平均面积最小；结节数量在PRGDN组最多而minTBP-1组最少。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R783

【参考文献】