鸢尾素（irisin）对牵张成骨细胞模型的作用及其分子机制的研究

发布时间：2020-06-09 16:13

【摘要】：目的:鸢尾素(irisin)是由骨骼肌在运动过后大量分泌的肌肉因子。近年来研究表明irisin除了在糖脂代谢中具有重要作用外,irisin与骨组织代谢和力学作用之间存在密切联系。故本实验研究了体外条件下irisin与力学因素作用在促进大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells,BMSCs)成骨向分化之间的作用。首先研究不同浓度irisin对大鼠BMSCs增殖及成骨标志物表达的影响,筛选出最适irisin浓度。以筛选出的最佳irisin浓度为参考,研究此浓度的irisin对静态及牵张力作用下大鼠BMSCs成骨向分化的影响。方法:一、分离培养原代大鼠BMSCs并行流式细胞鉴定。实验按照irisin浓度分组如下:A:0ng/mL、B:10ng/mL、C:50ng/mL、D:100ng/mL、E:500ng/mL。采用CCK-8法检测各组细胞0-7天的增殖情况。采用ALP(Alkaline phosphatase)染色及ALP活性实验来检测各组细胞碱性磷酸酶的表达差异;定量逆转录PCR(Quantitative reverse transcription Polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测各组细胞成骨相关标志物:ALP、Runx2(成骨核心转录因子)、OPN(Osteopontin,骨桥蛋白)mRNA表达;Western Blot检测成骨标志物:Runx2蛋白的表达。二、取第3代大鼠BMSCs,应用四点弯曲细胞加力仪建立体外细胞牵张模型。依据筛选出的最适irisin浓度。实验分组如下:(A)对照组、(B)irisin组(100ng/mL irisin)、(C)牵张力组(2000με牵张力)、(D)irisin+牵张力组(100ng/mL irisin+2000με牵张力)。细胞计数法检测在静态及牵张力作用下,各组细胞增殖情况;ALP染色、茜素红染色检测各组细胞成骨向分化早期及晚期的差异,通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)及Western Blot检测成骨相关mRNA及蛋白的表达,并检测P38、ERK1/2MAPK信号通路的表达情况。对所得实验数据,严格进行统计分析。结果:一、CCK-8检测结果示:10-100ng/mL浓度范围irisin可促进大鼠BMSCs增殖(P0.05),其中100ng/mL irisin促进大鼠BMSCs增殖作用最显著(P0.01)。ALP染色及ALP活性检测结果、qRT-PCR及Western Blot结果进一步证实:irisin可促进ALP、OPN、Runx2 mRNA及蛋白表达,100ng/mL的irisin可能为促进大鼠BMSCs成骨向分化的最佳浓度。二、细胞增殖检测结果示:与对照组相比,irisin+牵张力组可促进大鼠BMSCs的增殖(P0.05)。ALP及茜素红染色结果均显示irisin+牵张力组促进大鼠BMSCs成骨效果均显著高于其他组。qRT-PCR结果示:irisin+牵张力可促进成骨标志物Runx2、ALP、COL-Ⅰ、OPN表达的升高(P0.05)。Western Blot结果示:irisin+牵张力可促进Runx2蛋白表达的升高(P0.05)。此外,irisin+牵张力联合作用促进大鼠BMSCs增殖与成骨向分化的机制可能与P38、ERK1/2 MAPK通路的激活有关。结论:irisin可促进大鼠BMSCs增殖及成骨向分化,irisin浓度为100ng/mL时可能为促进大鼠BMSCs增殖、成骨向分化的最佳浓度。irisin对静态和体外牵张力作用下大鼠BMSCs增殖及成骨向分化具有促进作用,此效应可能通过P38、ERK1/2 MAPK通路发挥作用。
【图文】：

原代（P0）大鼠 BMSCs 第 3 代(P3)大鼠 BMSCs图 1.1. SD 大鼠骨髓间充质干细胞镜下照片Figure 1.1 .Photograph of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells：Primary (P0) ratBMSCs and Third generation (P3) rat BMSCs.图 1.2. 流式细胞鉴定结果Figure1. 2. Flow cytometry results:CD29 expression rate: 99.87%, CD44 expression rate:90.78%, CD45 expression rate: 0.25%.

达率:90.78%,白细胞标志抗原CD45表达率:0.25%,此表面抗原鉴定结果符合骨髓间充质干细胞的表面标志物特征。原代（P0）大鼠 BMSCs 第 3 代(P3)大鼠 BMSCs图 1.1. SD 大鼠骨髓间充质干细胞镜下照片Figure 1.1 .Photograph of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells：Primary (P0) ratBMSCs and Third generation (P3) rat BMSCs.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R782.4

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本文编号：2704933