三七总皂苷对内皮祖细胞生物学特性的影响及活化Wnt信号通路的初步探讨

发布时间：2020-06-10 08:13

【摘要】：目的:牵张成骨(distraction osteogenesis,DO)是一种截骨后对带血管蒂的骨块进行持续牵张,进而牵张间隙中有新骨形成的骨再生过程。除了骨再生过程,血管形成过程对于牵张成骨同样不可缺少。三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)是传统中药三七的有效活性成分,课题组前期发现PNS可促进牵张成骨的成骨过程,且在牵张区域检测到内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面标记物的高表达,我们推测PNS对牵张成骨过程中的血管形成也有一定影响,故在此研究中,我们在体外实验运用含不同浓度PNS的培养基培养犬骨髓来源EPCs,研究适宜浓度PNS是否会对EPCs的功能产生影响,及适宜浓度PNS是否会活化内皮祖细胞上的Wnt信号通路,为进一步在体内实验研究PNS对牵张成骨过程中血管形成过程的影响奠定基础。方法:1.犬EPCs的分离培养、功能鉴定及PNS对EPCs生物学特性的影响:首先运用密度梯度离心法结合差速贴壁法对犬EPCs进行分离培养,运用免疫荧光鉴定EPCs表面标记物,迁移实验检测EPCs的迁移功能,成管实验检测EPCs的成管能力,免疫荧光检测EPCs VEGF、bFGF的表达;再运用CCK-8增殖实验检测不同浓度PNS对EPCs增殖的影响;运用细胞迁移实验检测不同浓度PNS对EPCs迁移能力的影响;运用PCR检测不同浓度PNS对EPCs VEGF、bFGF基因水平表达的影响;运用免疫组化检测不同浓度PNS对EPCs表达VEGF的影响,免疫荧光检测不同浓度PNS对EPCs表达bFGF的影响。2.PNS对内皮祖细胞Wnt信号通路活化的影响:先运用PCR检测不同浓度PNS对Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、负性调控蛋白GSK-3β及下游靶基因cyclin D1的基因水平表达的影响;再运用免疫组化和Western Blot检测不同浓度PNS对Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、负性调控蛋白GSK-3β及下游靶基因cyclin D1蛋白表达的影响。结果:1.犬EPCs的分离培养、功能鉴定及PNS对EPCs生物学特性的影响:倒置显微镜下观察到原代EPCs成簇生长,刚贴壁时呈圆形,后来呈长梭形、多角形、纺锤形;免疫荧光结果显示EPCs表达CD133、CD34;细胞迁移实验中,Transwell小室上室种入EPCs后,24小时后可在下室观察到细胞的迁移,48小时后可见迁移增多;基质胶成管实验中,6小时后可观察到EPCs在基质胶中形成“管腔”样结构;免疫荧光结果显示EPCs表达VEGF、bFGF;CCK-8增殖实验结果显示PNS浓度在低于或等于6.25mg/L时可促进EPCs增殖,高于6.25mg/L时,则可能会对EPCs的增殖产生抑制;细胞迁移实验结果显示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可促进内皮祖细胞的迁移,6.25mg/L的PNS更能促进EPCs迁移(P0.05);PCR结果显示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可上调内皮祖细胞VEGF、bFGF基因水平的表达(P0.05),6.25mg/L的PNS更能上调内皮祖细胞VEGF、bFGF基因水平的表达(P0.05);免疫组化和荧光的结果显示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可促进内皮祖细胞VEGF和bFGF的蛋白表达(P0.05),6.25mg/L的PNS更能促进内皮祖细胞VEGF和bFGF的蛋白表达(P0.05);2.PNS对内皮祖细胞Wnt信号通路活化的影响:PCR、免疫组化、WB结果显示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可上调Wnt信号通路关键蛋白β-catenin及下游靶基因cyclin D1的基因和蛋白水平的表达(P0.05),6.25mg/L的PNS更能上调β-catenin及cyclin D1的基因及蛋白水平的表达(P0.05);6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可下调Wnt信号通路负性调控蛋白GSK-3β的基因及蛋白水平的表达(P0.05),6.25mg/L的PNS更能下调GSK-3β的基因及蛋白水平的表达(P0.05)。结论:1.适宜浓度的PNS可促进内皮祖细胞的增殖,迁移能力,及VEGF、bFGF的表达;2.PNS可通过上调Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、下游靶基因cyclin D1的表达,下调Wnt信号通路负性调控蛋白GSK-3β的表达参与Wnt信号通路的活化。
【图文】：

图 1-1 内皮祖细胞形态（A、D：呈纺锤形，，长梭形 B：呈“线性排列” C：呈簇状生长;A,B,C,D×100）Fig.1-1 Morphology of Endothelial progenitor cells (A, D: spindle-shaped, long-fusiform B:"lineararrangement" C: clustered growth; A,B,C,D×100)

CD34的表达(A:CD34;B:DAPI;C:Merge;A,B,C×100)
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.5

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本文编号：2706029