颅神经嵴细胞的培养特性及向神经细胞、成骨细胞的定向诱导分化

发布时间：2020-06-11 23:18

【摘要】： 神经嵴细胞(Neural Crest Cells，NCC)来源于胚胎的神经外胚层，在发育的过程中，离开神经管向腹侧迁移，分化为神经元、神经胶质细胞及多种非神经细胞，是机体内最具分化潜能的细胞之一。颌面部的牙乳头、牙囊、牙周膜、骨组织以及肌肉中的大部分细胞均来源于颅神经嵴(Cranial neural crest cells，CNCC)。因此，研究CNCC的发育和定向分化在对于理解颌面部组织和器官的形成十分必要。此外，多潜能性也使其成为组织工程中候选的种子细胞之一。虽然人们早已通过体内试验了解到CNCC可以向神经谱系、成骨细胞、成牙本质细胞等方向进行分化，但在体外的试验中，由于面临CNCC的分离、取材以及在普通培养基中容易分化等方面的困难，目前还不十分清楚CNCC在体外如何向各个细胞谱系进行分化，生长因子对CNCC的确切作用也未见报道。为了明确CNCC的体外培养特性和定向诱导分化的条件，本实验从CNCC的两大分化方向——神经谱系和成骨细胞两个方面，进行了以下几方面的研究： (1)取E8.5 Balb/C胎鼠第6体节之前的神经管，用无血清培养基培养CNCC。在神经管组织贴附后2d，剔除神经管，原代的CNCC从组织块周围游出，形态第四军医大学博士学位论文类似成纤维样细胞：由生长曲线计算得出＊＊＊C的倍增时间为3个4h；免疫组化结果显示，CNCC的特异性抗体一神经生长因子低亲和力受体的抗体p75染色阳性，Cytokeratm、Vimentin、NF、GFAP染色均为阴性。口）观察血清对CNCC分化的诱导作用，研究结果显示，血清处理组中，， CNCC的形态由原来的成纤维样变为细长型，GFAP抗体染色为阳性；而正常无血清组的CNCC中，GFAP染色结果为阴性。因此，血清可诱导CNCC向神经胶质样的细胞分化。 O）观察不同浓度的rhBMPZ对CNCC的作用。在50ng／ml的thBMPZ培养基中培养 10天后，CNCC的形态由成纤维样细胞转变为突起长度不等的、类似于神经元的细胞。而在常规的无血清培养基中，CNCC的形态基本无变化。诱导后的CNCC中NF的免疫组化染色结果呈阳性反应。透射电镜下，rhBMPZ 处理组中，内质网和线粒体的数量减少，并出现了类似神经内分泌的颗粒以及神经元突起样的结构。表明thBMPZ可以诱导CNCC向神经元方向分化。通过计算NF阳性细胞数可以得出，rhBMPZ作用的最适剂量为50ng／ml，其诱导出的神经元样细胞的比例为 47．l％。 O 诱导CNCC前后，细胞中TH以及GAB蝴亚单位InRNA的表达有明显变化。RT．PCR检测结果表明，rhBMPZ正常对照组的CNCC中，二者未见表达。而在处理组中，二者均出现表达，表明CNCC在诱导后所分化的神经元是一种类似肾上腺能的神经元c m通过脂质体介导的方法，将 BMPZ基因导入 CNCC，经过 G＊筛选获得了稳定表达BMPZ的CNCC细胞株，并通过免疫组化、原位杂交方法从蛋白水平和转录水平证实了转染后的细胞能够表达并分泌BMPZ。BMPZ转染后的细胞形态发生改变，细胞周围出现多个突起，形态类似神经元，NF抗体呈阳性反应，说明转染后的CNCC表现出神经元的表型。的用矿化诱导液培养CNCC，观察其对CNCC是否可以诱导CNCC向成骨细胞进行分化。用矿化诱导液培养20d后，细胞形态由长梭形向多角形转化， 5 第四军医大学博士学位论文群体倍增时间延长为57．sh，增殖速度减慢，但细胞中ALP活性和OC含量比正常的＊＊＊C明显提高（P＜o．os）。上述研究结果表明，无血清培养基能够维持CNCC的未分化状态；血清可以诱导CNCC分化为神经胶质样的细胞，含血清的培养基不能用来培养CNCC； 50ng／Inl的 rhBMPZ可以有效地促进 CNCC分化为神经元样的细胞，并表达 TH 和GABM亚单位InRNA；分化后的细胞类似肾上腺能神经元；BMPZ基因转染的细胞也表现出神经元的表型，进一步确定了BMPZ对CNCC的定向诱导分化作用；用矿化诱导液则可以诱导CNCC表现出成骨细胞的表型。研究结果提示，CNCC的培养需要特殊的无血清培养基；CNCC处于未分化状态，在不同的分化因素的刺激下，可向神经胶质细胞、神经元和成骨细胞的表型分化，可用来在体外研究颌面部组织和器官的发育，也可作为组织工程中后选的种子细胞。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R780.2

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