辐射致伤HSG细胞后MBD2对AQP5表达调控及机制研究

发布时间：2020-06-13 18:04

【摘要】：临床实践表明：口腔颌面部恶性肿瘤(鼻咽癌、口腔癌和咽喉癌)患者，经放射治疗后，往往损伤唾液腺导致进行性唾液分泌减少，出现口干症状，其临床表现与干燥综合征(Sjogren‘s syndrome,SS)十分类似。干燥综合征(SS)是一类慢性自身免疫性疾病。病因学研究发现：水通道蛋白5(AQP5)的合成和表达异常与SS的发病密切相关,其表达降低是导致SS唾液分泌异常的重要原因。有研究表明：DNA甲基化参与了AQP5表达调控，是AQP5基因表达受抑的重要机制。去甲基化酶(MBD2)是DNA甲基化的重要组成部分。具有甲基化沉默能力的基因,又具去甲基化酶活性的DNA甲基化调控蛋白,在多种肿瘤的表观遗传学调控中扮演着重要角色。经生物学软件测试分析，作为甲基化体系中的重要组成部分，去甲基化酶MBD2(methyl-CpG binding domain2)可以调控AQP5甲基化状态，但参与AQP5表达调控及其机制尚不清楚。 目的：为验证MBD2与AQP5的分子调控关系。建立辐射致伤颌下腺细胞(humansubmandibular gland，HSG)模型，通过MBD2调控途径，定向控制和调高AQP5的合成与表达，初步探讨MBD2在AQP5表达调控中的相互作用及调控机理，为干燥综合征的临床治疗提供新的视角。 方法：在前期AQP5和SS相关研究及生物信息学测试分析的基础上，本课题在分子、细胞的层次研究二者关系。首先，通过构建电离辐射致伤人颌下腺(humansubmandibular gland，HSG)细胞模型。利用免疫荧光、RT-PCR、western-blot的方法检测HSG细胞系在辐射前后AQP5的差异表达。然后，通过构建MBD2腺病毒过表达载体并转染到HSG细胞系中，为了证明MBD2对AQP5的调控关系，利用RT-PCR、western-blot的方法验证AQP5的表达水平的变化。 结果：1、成功构建电离辐射致伤人颌下腺(human submandibular gland，HSG)细胞模型。2、通过RT-PCR、western-blot、免疫荧光的方法证明：AQP5在60钴γ射线辐射后，无论是其mRNA水平，还是蛋白质水平的表达都会被抑制。3、成功构建MBD2的腺病毒表达载体。4、在HSG细胞系中，MBD2能够促进AQP5的表达。 本实验，，通过对HSG细胞模型的研究，以RT-PCR、免疫荧光技术、蛋白印迹技术研究AQP5在不同条件下的表达水平。初步判定MBD2与AQP5的表达关系。在后续实验中，借助于双荧光启动子报告系统、EMSA、染色质免疫沉淀(CHIP)等方法检测MBD2参与AQP5表达模式，深入探讨MBD2在AQP5表达调控中的相互作用及调控机理，为进一步以去甲基化角度针对AQP5展开SS的治疗提供理论和实验依据。
【图文】：

感染 Ad/MBD2 病毒 48 h 的A 序列，而空载体感染的细胞。M 1 2镜下，未感染 HSG 细胞不表达绿色荧光的 HSG 细胞表达强绿色荧光蛋白(B)，B

第三军医大学硕士学位论文MBD2 重组腺病毒经 293 细胞包装后 8 d，倒置显微镜下可见非常明显的，细胞变圆、肿胀、脱壁，核变大等病变。病毒细胞经 5 轮传代扩增以后大量扩增，采用倍比稀释法测定其滴度为：1.41×1011IU/mL。重组腺病毒载体 Ad/MBD2 转染靶细胞及转染后的检测(见照片 4)MBD2 病毒液感染 HSG 细胞(图 5A)，48 h 后，倒置荧光显微镜下见大部绿色荧光蛋白(图 5B)，图像分析法算得细胞感染率约 70%。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.8

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 莫颖倩;戴冽;李婷;郑东辉;苏剑华;张白玉;;抗α-胞衬蛋白抗体在干燥综合征诊断及病情判断中的作用[J];国际内科学杂志;2009年01期

2 杨军;马龙;史文进;杨彦春;张从纪;;腺病毒介导CTLA4Ig对舍格伦综合征小鼠颌下腺AQP5表达的影响[J];临床口腔医学杂志;2006年04期

本文编号：2711542