miR-21通过靶向TIMP-3抑制IL-6诱导的小鼠颞下颌关节细胞外基质的降解

发布时间：2020-06-13 19:30

【摘要】：目的:颞下颂关节炎(temporomandibularjointosteoaritis,TMJ-OA)是口腔颌面部常见的疾病之一,常伴颞下颌关节区疼痛;张口受限;伴有骨赘增生时,可有摩擦音等症状,严重影响患者的日常生活。目前的研究现状多集中在软骨细胞的自噬、信号通路的失调、节律基因等方面。但其具体的发病机制尚未完全明了。非编码小RNA(miRNA)是一种长度约22-24个核苷酸的小RNA,其通过与靶基因mRNA结合抑制蛋白翻译过程。非编码小RNA自发现已25余年,因其众多的靶基因为原癌基因及抑癌基因,其在肿瘤领域而备受关注。但其在关节炎的研究则鲜有报道。本课题目的是探讨miR-21与颞下颌关节炎(temporomandibular joint osteoaritis,TMJ-OA)的关系,明确miR-21通过靶向TIMP-3来调控IL-6介导的小鼠髁突软骨细胞外基质的降解及VEGF-A的表达。方法:(1)采用3-4周龄C57小鼠提取髁突软骨细胞,在无菌环境下,采用“脱帽法”分离小鼠髁突,将小鼠髁突软骨冲洗,剪碎,仔细剪切至1r丨mm3的碎块。软骨块中加入0.25%的胰酶置于37℃恒温箱孵育10分钟,然后,在浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶和0.25%的dispase酶Ⅱ中消化2小时。将提取的原代的小鼠髁突软骨细胞体外培养,镜检观察其生长变化情况和细胞形态,并用细胞形态学方法鉴定分离、培养的细胞为髁突软骨细胞。将提取的小鼠髁突软骨细胞随机分为四组,即miR-21 inhibitor NC组,miR-21 inhibitor组,miR-21 inhibitor NC+IL-6组,miR-21 inhibitor+IL-6组。使用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,9孔培养板每孔接种细胞5×103个,每孔加10ul细胞计数试剂kit-8,分别于6h、48h细胞计数,酶标仪在450nm处记录吸光值;(2)qRT-PCR和Western b1ot检测miRNA-21模拟物其抑制剂对TIMP-3、MMP-9、VEGF-1、col-1、AggmRNA及蛋白表达的影响(3)取第2代处于对数生长期髁突软骨细胞随机分为四组,分别用O、1、5、1Ong/mlIL-6处理24小时,对各组之间TIMP-3、Agg、col-蛋白和mRNA表达量进行检测,并筛选出能造成髁突软骨细胞炎性状态的IL-6最佳浓度。Western blot检测miR-21 inhibitor NC组,miR-21 inhibitor组,miR-21 inhibitor NC+IL-6组,miR-21 inhibitor+IL-6组,中TIMP-3、MMP-9、VEGF-、col-1、agg蛋白的表达;microRNA靶基因数据库预测miRNA-21靶基因TIMP-3,双荧光素酶标记实验用于验证miR-21的靶基因;(4)验证TIMP-3是否参与miR-21对细胞外基质的作用,该实验分为两部分,第一部分分组:miR-21-NC+TIMP-3-NC组、miR-21-NC+siTIMP-3组、miR-21-inhibitor+siTIMP-3-NC组、miR-21-inhibitor+siTIMP-3组;第二部分各组应用10ng/ml IL-6以验证其在急性炎症中的作用,白介素6刺激24h后,rt-PCR和western用于测定TIMP-3,2型胶原,agg,VEGF-A和MMP-9的mRNA和蛋白的在各组的表达。结果:(1)镜检见分离的原代小鼠髁突软骨细胞呈卵圆形,形态规则,体外培养5—7天后,可见呈“铺路石”样外观,形态饱满。(2)miR-21 inhibitor对比miR-21-NC组,在mRNA和蛋白水平上,MMP9,VEGF-A表达显著下调,而coll,Agg,TIMP-3表达显著上调。miR-21 mimic对比miR-21-NC组显著上调MMP-9、VEGF-A表达,下调col-l、Agg的表达;(3)Agg,col-1,TIMP-3表达量随IL-6浓度上调而下降;测定WT组,miR-21敲除组,WT+IL-6组和miR-21敲除+IL-6组中特定基因的表达,结果提示在10ng/ml IL-6刺激下,较wt组,miR-21敲除组中Agg,TIMP-3表达显著上调,MMP-9表达显著下调。下调miR-21表达可延缓IL-6介导的急性炎症,减少细胞外基质的降解。在IL-6刺激下,相较于miR-21 inhibitor组,miR-21 inhibitor-NC组VEGF-A表达量显著下调;同时CCK-8增殖试验证实miR-21 inhibitor组的软骨细胞增值速度优于miR-21 inhibitor-NC组。miR-21 inhibitor-NC+IL-6组细胞的生长速度慢于miR-21 inhibitor +IL-6组。(4)软骨细胞转染TIMP-3 siRNA后,TIMP-3蛋白和mRNA表达量显著下调,并可下调col-1,Agg的表达和上调VEGF-A和MMP-9的表达。对比共转染miR-21-inhibitor和siTIMP-3-NC组,共转染miR-21-inhibitor和si-TIMP3组可显著下调Agg,coll的蛋白和mRNA表达,同时上调VEGF-A和MMP-9的表达。4组细胞均应用10ng/ml IL-6刺激24h,可产生与未应用IL-6刺激组相似的效果.
【图文】：

小鼠,转染,髁突软骨,对照组

在ＣＣＫ－８实验中，小鼠髁突软骨细胞转染ｍｉＲ－２〗ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ后，相较于对照组，逡逑细胞增殖加快，两组之间有统计学差异（Ｐ＜０．０５）。给与１０ｎｇ／ｍｌ邋ＩＬ－６刺激后，逡逑ＣＣＫ－８试验显示出相似的结果（图４）。逡逑１．４．实验三ＭｉＲ－２１对ＩＬ－６介导的炎性髁突软骨的细胞外基质的影响逡逑１．４．１实验方法逡逑（１）取Ｐ２邋ＭＣＣｓ，随机分为４组，分组如表２逡逑表２．邋ＭｉＲ－２１对炎性髁突软骨的关键蛋白及细胞外基质的影响实验分组逡逑分组逦ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ＮＣ逦ＮＣ＋邋ＩＬ－６逦＋邋ＩＬ－６逡逑（２）其余步骤同１．２．１逡逑１．４．２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋检测邋Ｔｉｍｐ－３邋及邋Ａｇｇ、Ｃｏｌ－１、ＭＭＰ－９邋和邋ＶＥＧＦ－Ａ邋的蛋白表达水逡逑平逡逑同邋１．２．３逡逑１．４．２结果逡逑２５逡逑

互补序列

逦ｒｖｉｏｒ逡逑图６逡逑ＭｉＲＢａｓｅ提示：ｍｉＲ－２１与ＴＩＭＰ－３有互补序列（图６Ａ）。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析显示转入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ会有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表达，而其逡逑ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ会增高Ｔｉｍｐ－３的表达（图６Ｂ）。逡逑荧光素酶实验结果显示（图６Ｃ），ＭｉＲ－２１会有效抑制ＷＴ中ＴＩＭＰ－３的荧光素逡逑酶效应，而在突变型中，，我们阻断了邋ＭｉＲ－２１的活性位点，从而阻止了次抑制效逡逑应。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析也显示转入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ会有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表达，而逡逑其ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ会增高Ｔｉｍｐ－３的表达。逡逑２邋实验二ＭｉＲ－２１靶向ＴＩＭＰ－３调控ＩＬ－６介导的细胞外基质的降解逡逑２．１实验试剂与仪器逡逑２．邋１．１主要试剂逡逑Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋Ｍｕｒｉｎｅ邋ＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，美国）；逡逑Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ邋２０００邋ｒｅａｇｅｎｔ邋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，邋ＵＳＡ）逡逑Ｉ型胶原兔抗小鼠多克隆抗体（Ｓｉｇｍａ，美国）；逡逑２９逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R782.6

【相似文献】