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胆碱乙酰转移酶在人牙周膜细胞中的表达及尼古丁对其表达的影响

发布时间:2020-06-14 21:05
【摘要】: 吸烟损伤牙周组织,是慢性牙周炎的主要危险因素。吸烟人群牙周炎的发病率远远高于非吸烟人群,并且在牙周炎患者中,吸烟人群的牙周组织破坏更加明显。尼古丁作为烟草中的主要生物碱,除可直接损伤牙周组织,还可通过妨碍牙周组织免疫系统正常功能加速其损坏,但确切作用机制尚未明了。 研究发现,胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)在尼古丁对机体组织损伤过程中发挥重要作用。为观察胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase , ChAT)在人牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament fibroblast,PDLF)中的表达,并探讨ChAT调节在参与尼古丁对PDLF损伤过程中的作用,本研究通过建立尼古丁作用下PDLF体外实验模型,采用RT-PCR,DNA测序和免疫组化等方法,观察PDLF中是否存在ChAT及在尼古丁作用下其表达的改变。旨在探讨ChAT在尼古丁与吸烟相关性牙周炎发生发展中的作用,为寻找新的牙周炎防治途径提供理论和实验依据。 1人牙周膜成纤维细胞中ChAT的表达 取12-18岁志愿者正畸减数拔除的健康第一前磨牙,刮取根中1/3处牙周膜组织,改良组织块法原代培养PDLF,鉴定,传代,4-6代细胞用于实验。采用免疫荧光及RT-PCR方法检测PDLF中ChAT的表达。免疫荧光结果显示,PDLF胞浆中存在ChAT的阳性表达;RT-PCR结果显示在与阳性对照组相同位置299 bp处可见阳性条带,且经克隆测序证实扩增产物为ChAT。初步证实,在PDLF中存在ChAT蛋白及mRNA表达。 2尼古丁对ChAT在人牙周膜成纤维细胞中表达的影响 第4代PDLF随机分为两组,对照组:5%新生牛血清DMEM培养液;实验组:尼古丁硫酸盐(10-12mol/L)溶于含5%新生牛血清DMEM培养液。37℃、5% CO2孵箱中孵育24h。RT-PCR、实时定量PCR及免疫荧光方法检测尼古丁对ChAT在PDLF表达的影响。 免疫荧光结果显示,正常及尼古丁作用下PDLF存在ChAT阳性表达,表达主要位于胞浆。与对照组相比,尼古丁作用24h后,实验组PDLF ChAT阳性信号增强。RT-PCR结果表明,与对照组相比,尼古丁作用24h后PDLF PCR扩增产物ChAT mRNA阳性表达增强;经quantity one分析,表达水平差异有统计学意义(P㩳0.05),实时定量PCR进一步证实该结果。 以上结果证实,PDLF中存在ChAT蛋白、mRNA表达;尼古丁可明显上调其表达。由此推测ChAT可能为尼古丁在牙周组织的作用靶点,在吸烟相关性牙周炎的发生发展中发挥了重要作用。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R781.4
【图文】:

原代培养,细胞培养,波形丝蛋白,中胚层


图1 PDLF 原代及第4代细胞培养P0:PDLF 原代培养 P4:PDLF 第4代培养1.4.2 细胞鉴定第4代培养细胞经免疫组化染色鉴定,波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明所培养细胞为来自中胚层(图2)。IHCIHCV 10× C10×

波形丝蛋白,角蛋白,免疫组化染色


1.4.2 细胞鉴定第4代培养细胞经免疫组化染色鉴定,波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明所培养细胞为来自中胚层(图2)。图2 波形丝蛋白及角蛋白免疫组化染色V:波形丝蛋白 C:角蛋白IHCIHCV 10× C10×

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