Bcl-2家族成员在莱菔硫烷诱导人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中的作用

发布时间：2020-06-16 16:09

【摘要】：目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一。好发于腭部的小唾液腺及腮腺，其次为下颌下腺。该肿瘤具有转移性极强、易沿神经扩散和血行性转移率高等重要特征，其发病率在口腔颌面部恶性肿瘤中居第二位。目前对于涎腺腺样囊性癌的临床治疗手段以手术切除为主，但手术切除后也常会发生局部复发和远处转移，其远端转移率在口腔颌面部居首位。然而，涎腺腺样囊性癌的发病及转移机制目前仍不完全清楚。因此探索新的预防和治疗方法，提高对涎腺腺样囊性癌的疗效，改善患者的生存质量是很有必要的。流行病学调查研究发现增加十字花科蔬菜的摄入能够减少癌症的发生，其抗肿瘤作用的主要成分是一系列异硫氰酸酯，其中莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）因其抗肿瘤效果最佳而受到广泛关注。随着对莱菔硫烷抗肿瘤作用研究的不断进展，目前对其抗癌机制的研究已从细胞水平上升至分子水平。如在DU-145细胞（前列腺癌）中，SFN引起细胞凋亡伴有裂解的Caspase-3增加和Bcl-2表达的减少。在胰腺癌细胞中也可引起Caspase-3的裂解。SFN可通过激活多种分子机制，来诱导细胞的凋亡。我们前期的实验结果表明，SFN能够抑制腺样囊性癌细胞ACC-M的增殖，并诱导其凋亡。并且Caspase在SFN诱导涎腺腺样囊性癌ACC-M凋亡过程中起重要作用。但是在SFN诱导人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞凋亡的过程中，Bcl-2家族成员是否起重要作用，国内外未见报道。本研究拟对体外培养的人腺样囊性癌细胞系ACC-M经过SFN处理后，采用Western Blot方法，检测不同时间点抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl以及促凋亡蛋白Bax，Bak的含量，验证在SFN诱导ACC-M凋亡过程中Bcl-2家族成员的表达及意义，从而为在腺样囊性癌的多模式治疗中拓展新的植物化学药物提供实验依据。方法： 1材料 1.1ACC-M:由上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，细胞系建立于1995年； 1.2莱菔硫烷（SFN）：由匹兹堡大学医学中心头颈外科提供，购自LKT实验室，纯度≥99%。 2方法 2.1药液配制：莱菔硫烷（SFN）用二甲基亚砜（DMSO)溶解配制成100mmol/L的储存液，存于-20℃冰箱中，使用前用RPMI1640培养液稀释。 2.2细胞培养：将冻存的细胞系予以复苏，培养液采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和链霉素（100μg/mL）、青霉素（100U/mL），将复苏后的细胞置于37℃、5%CO2恒温恒湿箱培养，隔天换液，约72-96小时可以传代。 2.3细胞接种及药物处理：取对数生长期细胞经消化液（0.25%胰蛋白酶和0.04％EDTA（1:1）混合液）消化后制成4.0×106个/ml的细胞悬液，根据相应时间点分别接种于对照组、4小时组、8小时组、16小时组、24小时组五个培养瓶中，每个培养瓶接种2ml的细胞悬液，放入培养箱。待细胞贴壁（接种后24小时）后进行药物处理。将100mmol/L的莱菔硫烷（SFN）储存液稀释成浓度为40μmol/L的溶液，将贴壁后的细胞从培养箱取出，弃掉培养液，于4，8，16，24各组中分别加入浓度为40μmol/L的莱菔硫烷溶液3ml，于对照组加入含相同浓度二甲基亚砜的RPMI1640培养液3ml作为对照。待药物作用4、8、16、24小时后进行各组细胞组织蛋白的提取。 2.4细胞组织蛋白的提取：将对照组和经药物处理的细胞用PBS平衡盐溶液洗涤两遍，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，各自移入相应EP管中。4℃下，3000rmp，离心15min。吸走上清液，留沉淀，经再次PBS洗涤吹打后，800rmp，离心5min，弃上清。于对照组和实验组中各加入细胞裂解液400μl，放于冰上裂解20-30min（震荡均匀后裂解）。将裂解后的细胞于4℃下，13000rmp，离心15min，离心完毕取上清液即为所提取的细胞蛋白，将蛋白分装至相应EP管-80℃保存备用。 2.5蛋白的定量：利用分光光度仪法测定蛋白浓度。分光光度法是通过测定被测物质在一定波长范围内光的吸收度，从而对该物质进行定性和定量分析。本实验在波长为595nm下测定各样本吸光度值。根据公式：蛋白含量=测定蛋白吸光度值/标准蛋白吸光度值×标准蛋白浓度（0.563g/l)×10得出测定样品蛋白浓度。 2.6采用western blot免疫印迹技术检测促凋亡蛋白Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达：经SDS--PAGE(电泳)；转膜；封闭；孵育一抗二抗；洗涤；暗室显影定影等过程获得蛋白条带胶片，之后利用电泳凝胶成像分析软件,对其结果进行量化分析,采用统计学软件包对结果进行方差分析。 3统计学分析上述实验均重复三遍，汇总所得的实验数据，应用统计学方法对实验结果进行计算分析。结果: 结果显示：经40μmol/L SFN处理后，人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞中Bax蛋白的表达有随着药物作用时间延长呈逐渐增加趋势，Bak蛋白的表达量也随着时间延长有所增加，但不如Bax蛋白明显；而Bcl-2蛋白和Bcl-xl蛋白的表达则随着作用时间延长有逐渐减少趋势。Bax:Bcl-2比率增加。ACC-M细胞系经40μmol/LSFN作用24小时,其Bax蛋白的表达量是对照组的1.63倍(P0.001), Bak蛋白较对照组增加了的44%(P0.001)，而Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达量分别减少至对照组的43%和41%(P0.001)。Bax/Bcl-2的比值随时间延长逐渐增大，8小时组、16小时组、24小时组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01)。结论：莱菔硫烷诱导涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡，与其上调Bax、Bak蛋白的表达,以及下调Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表达，Bax/Bcl-2蛋白比例增加有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.8

【参考文献】