口腔鳞癌组织和癌旁组织中miRNA和mRNA表达谱的构建与对接研究

发布时间：2020-06-19 10:14

【摘要】：[背景]口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinomas，oscc）是头颈部恶性肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，容易发生细胞侵袭和转移导致患者预后较差。尽管口腔鳞状细胞癌在临床诊断、临床治疗各个环节不断进步，但患者术后五年的存活率仍低于50%，这个数字在最近30年一直未得到有效的改变。研究表明，miRNA是肿瘤细胞发生发展的关键调节因子，通过配对目标基因的蛋白质编码基因，诱导mRNA的降解或者翻译的抑制，参与调控不同肿瘤细胞的进程。目前的研究发现， miRNA在口腔鳞状细胞癌发生和发展中扮演关键角色，但对于其具体的作用和机制尚未清楚。 本课题应用HiSeq deep sequencing(高通量深度测序)的方法，对口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织样本进行检测，参照miRBase和Genebank数据库，筛选口腔鳞癌中差异表达的miRNA和mRNA（差异表达miRNA的定义为：Fold-change1或者Fold-change-1，并且p-value0.01；差异表达mRNA的定义为：FDR≤0.001且倍数差异在2倍及以上的基因），构建口腔鳞癌差异miRNA和mRNA表达谱，探讨他们在口腔鳞癌发生发展中的表达变化规律；从表达水平上分析了差异miRNA和mRNA在口腔鳞癌中的相关关系；应用Real-time PCR方法，检测mir-20a-5p、ODZ3和TCHH在口腔鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况，对测序数据的可靠性和准确性进行验证。 [目的]我们应用HiSeq deep sequencing(高通量深度测序)的方法，构建miRNA和mRNA表达谱，筛选出差异性表达的miRNA和mRNA；初步分析miRNA和mRNA差异性表达在口腔鳞癌中的意义；并且对口腔鳞癌中差异性表达的miRNA/mRNA进行对接分析研究。为进一步研究miRNA在口腔鳞癌中的作用和机制提供理论和实验依据。 [方法]选取10例手术切除新鲜冻存的口腔鳞癌及其配对的癌旁正常组织，Trizol法提取总RNA，应用分光光度计测量RNA浓度；应用高通量测序技术，构建口腔鳞癌组织及其配对的癌旁正常组织miRNA/mRNA表达图谱并分析；通过生物信息学技术预测miRNA的靶基因；口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织显著差异miRNA/mRNA表达谱的对接分析；应用Real-Time PCR验证差异表达的miRNA和mRNA在口腔鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况。 [结果] （1）应用HiSeq deep sequencing(高通量深度测序)的方法，分析了10对口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织miRNA的表达情况，结合数据分析，我们对这些差异的miRNA在口腔鳞癌中的表达变化规律进行了总结分析，结果显示：有77个miRNA显著性差异表达，有24个miRNA表达下调，53个miRNA表达上调，提示这些miRNA与口腔鳞癌的发生密切相关。试验中发现：口腔鳞癌组织和癌旁组织中有19个和14个新miRNA未在miRBase数据库中注册。 （2）应用HiSeq deep sequencing(高通量深度测序)的方法，分析了10对口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织mRNA的表达情况，结合数据分析，我们对这些差异的mRNA在口腔鳞癌中的表达变化规律进行了总结分析，结果显示：在口腔鳞癌组织及其癌旁配对的正常组织中共发现14629个mRNA，其中，有1120个mRNA显著性表达上调，有178个mRNA显著性表达下调，提示这些mRNA的显著差异性表达与口腔鳞癌的发生密切相关。 （3）通过对口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织显著差异miRNA/mRNA表达谱的对接分析，我们发现：不同的miRNA，其对接的靶基因数目不一样，有可能为零，也有可能数量上千，例如：let-7c靶基因5301个；mir-17-5p靶基因6767个；mir-19a-3p靶基因7614个；mir-20a-5p靶基因为5865个，与之相反的是mir-184、mir-183-3p、mir-196a-5p等等靶基因确为零个；差异表达基因中对接的miRNA数目较多。受两种以上的miRNA的调控，例如：MAGEA11受let-7a-3p、let-7b-3p、let-7d-3p、let-7f-1-3p、let-7f-2-3p、mir-15a-5p、mir-16a-5p等12个miRNA的调控；COL1OA1受mir-24-1-5p、mir-26a-5p、let-7a-3p、let-7b-3p、let-7d-3p等11个miRNA的调控；EMR1受mir-17-3p、mir-19-3p、mir-19a-3p、mir-20a-3p、mir-25-3p、mir-26b-3p6个miRNA的调控；与此类似的mRNA还有ODZ3、BAALC、 LRRC17等等。以上这些基因的表达异常可能与miRNA的密切调控有关。在口腔鳞癌的发生发展中，调控差异基因表达的miRNA不尽相同，他们的表达机制也不近相同，可能以某个miRNA为主，多种miRNA共同参与为辅。 （4）Real-Time PCR实验表明，mir-20a-5p、ODZ3和TCHH表达情况与测序结果相符，可见，测序数据是可信的。 [结论]我们通过对同一批口腔鳞癌组织和配对的癌旁组织样本中显著差异的miRNA/mRNA动态表达谱的研究及对接分析，初步揭示了miRNA表达失调在口腔鳞癌中表达变化规律，进一步阐明了口腔鳞癌的发生发展的分子机制，为寻找有效的口腔鳞癌早期诊断及恶性进展的生物分子标志提供了充足的理论依据。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.8
【图文】：

垦绗宦畚?16 图 1：样本提取总 RNA 之后实验流程图1.3.3 Illumina HiSeq 2000 系统进行 miRNA 测序并分析：1.3.3.1 基于 HiSeq 高通量测序技术的小 RNA 数字化分析，采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)，可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子 RNA 序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子 RNA 并发现新的小分子 RNA，构建样品之间的小分子RNA 差异表达谱，为小分子 RNA 功能研究提供有力工具。

南京医科大学硕士学位论文 1.3.3.2 信息分析流程（图 2）：HiSeq 测序所得 50nt 序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到 high quality tags，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。将清理后的 high quality tags 分类注释，可以获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小 RNA 片段注释后，用剩下的未注释片段来进行：1. novel miRNA 的预测；2. 已知 miRNA 的碱基编辑预测。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 潘翠霞;;口腔鳞癌患者中肿瘤标志物评估[J];国外医学.口腔医学分册;1993年06期

2 戴群，廖健兴;口腔鳞癌术前应用平阳霉素的近期疗效观察[J];实用癌症杂志;1995年04期

3 田洪超;口腔鳞癌血清SOD活性的临床研究[J];国外医学.口腔医学分册;1998年03期

4 姚华,吴葆萱,吴求亮;EGFR在口腔粘膜鳞癌和癌前病变中的表达及意义[J];口腔医学;1999年01期

5 杨晓笛,袁祥民,沈望珍;口腔鳞癌3p24等位基因杂合缺失的研究[J];新疆医科大学学报;1999年01期

6 张书平,丁继芬;唾液中唾液酸、癌胚抗原测定在口腔鳞癌诊断中的意义[J];口腔医学;2003年05期

7 李卫星 ,张朝霞 ,张秀清 ,刘宣;口腔鳞癌端粒酶活性的检测及临床意义[J];现代口腔医学杂志;2003年01期

8 庄广鹏;VM方案化疗在口腔鳞癌综合治疗中应用及疗效评价[J];中国民康医学;2004年02期

9 高子彬,段玉芹,许彦枝,陈彦平,郭兰涛;基质金属蛋白酶2及其抑制剂在口腔鳞癌中的表达[J];中华口腔医学杂志;2004年03期

10 姚丽艳,张白凌;PCNA在口腔鳞癌中的表达及其临床意义[J];福建医药杂志;2005年01期

相关会议论文 前10条

1 陈黎;李宁;;miRNA在猪卵母细胞成熟过程中作用[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年

2 王星果;郁建锋;龚道清;顾志良;;鸡脂肪组织和骨骼肌miRNA的筛选和表达研究[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年

3 成海兰;姜孝成;;miRNA与水稻种子活力的相关性研究[A];第二届全国种子科学与技术学术研讨会论文摘要集[C];2011年

4 杨子学;陈宝安;;miRNA在淋巴造血和急性淋巴细胞白血病中的作用[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年

5 付彦;吴徐行;杨德英;谢跃;古小彬;王淑贤;杨光友;;犬恶丝虫成虫miRNA的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年

6 李霞;;MiRNA-miRNA Synergistic and Subpathway Network[A];第四届全国生物信息学与系统生物学学术大会论文集[C];2010年

7 何卓晶;洪艳;;病毒miRNA研究进展概述[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分会、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇编[C];2011年

8 邹丰;刘丽江;;miRNA在肿瘤转移中的研究进展[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会摘要集[C];2011年

9 王旭霞;赵作勤;薛立伟;;肿瘤转移相关基因在口腔鳞癌中的表达及其临床意义[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年

10 齐伟;毛弛;;原发口腔鳞癌颈ⅡB区转移的初步研究[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 何增寿;口腔鳞癌化疗可首选VM－26[N];中国医药报;2003年

2 仇 逸 祖 亮;研究证实：病毒感染可导致口腔鳞癌[N];中国高新技术产业导报;2001年

3 记者 张晔;细胞中“宅男宅女”是传递“信号”大使[N];科技日报;2010年

4 实习生 蒋洪涛　王昊魁;miRNA—21：让肿瘤对它“上瘾”[N];科技日报;2010年

5 仇逸 陈祖亮;砒霜能抑制口腔鳞癌[N];江苏科技报;2002年

6 记者 许琦敏;“全球特工”高效调控生命活动[N];文汇报;2010年

7 ;生物芯片 临床应用渐入佳境[N];健康报;2010年

8 蒋立明;建立研发基地 开发高新技术[N];绍兴日报;2009年

9 衣晓峰　陈英云;微小核苷酸：揭开心律失常和心源性猝死之谜[N];中国医药报;2010年

10 记者 常丽君;验血可比CT扫描提前28个月发现肺癌[N];科技日报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 张忱;大鼠癫痫持续状态后海马miRNA表达谱的研究[D];中南大学;2010年

2 卢韶华;肺癌患者组织及血浆miRNA肿瘤标记物的发现及验证[D];复旦大学;2010年

3 何艳;肝细胞肝癌相关基因中miRNA结合靶点内多态的筛选及功能分析[D];苏州大学;2010年

4 李帅;miRNA-101和miRNA-122功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

5 夏伟;临床肿瘤标本中差异miRNA的检测及mir-200b功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

6 刘伟;SAMP8小鼠海马异常表达miRNA的鉴定和初步功能研究[D];中国协和医科大学;2009年

7 罗红春;胃癌miRNA表达谱及胃癌中显著下调的miR-9和miR-433的功能研究[D];重庆医科大学;2010年

8 茅凌翔;肠道病毒71型分子流行病学调查及miRNA抑制肠道病毒71型体外复制的研究[D];江苏大学;2011年

9 张文辉;胃远端腺癌miRNA表达谱及miR-204调控机制的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年

10 阴祖军;胁迫诱导棉花microRNA的差异表达分析[D];山东农业大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 赵百慧;油松胚珠游离核分裂期miRNA的克隆与初步鉴定[D];北京林业大学;2010年

2 张坤山;调控过氧化物酶体生物合成与增殖的miRNA分析与鉴定[D];南昌大学;2010年

3 黎媚媚;内含子27碱基miRNA对内皮一氧化氮合酶调控机制的研究[D];南华大学;2010年

4 尤昊;抑制miRNA-21的表达对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其靶基因的探讨[D];安徽医科大学;2011年

5 杨文征;马铃薯保守性miRNAs的预测与验证[D];浙江理工大学;2010年

6 郑培明;白纹伊蚊miRNA的测序、鉴定及表达谱的初步分析[D];南方医科大学;2010年

7 黄宝春;内含子miRNA反馈调节其宿主基因表达和功能的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

8 罗荣;DmiR：小RNA转录组深度测序的miRNA预测[D];福建农林大学;2011年

9 薄维平;木薯耐寒相关microRNA的差异表达分析[D];海南大学;2010年

10 周鹏方;猪和甲型流感病毒microRNA预测软件系统[D];西北农林科技大学;2010年

本文编号：2720653