防龋用转基因番茄中外源目的蛋白表达稳定性研究

发布时间：2020-06-20 06:29

【摘要】：龋病是一种细菌感染性疾病,严重危害着人类的身体健康。因此,探索控制龋病的有效措施是当今龋病研究的紧迫任务。免疫防龋是控制龋病的有效手段之一。利用转基因植物来制备疫苗具有生产简单、成本低、直接口服等优点已引起国内外学者的广泛关注。 目的：检测转基因番茄中外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的表达,分析果实、叶片中外源重组蛋白的含量变化,明确转基因番茄果实的最佳采收时期,探讨果实中外源重组蛋白表达变化的机制,获得具有稳定高效的表达外源重组蛋白的转基因番茄植株个体,为下一步利用转基因植物技术生产可食防龋疫苗的研究和商业化种植打下良好的基础。 方法：提取转基因番茄可溶性蛋白,Western blot法检测转基因番茄果实中外源重组蛋白PAcA/CTB,PAcP/CTB表达;ELISA法检测果实、叶片中外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB占可溶性总蛋白含量变化。 1提取转基因番茄果实可溶性蛋白,并采用Western blot法检测外源重组蛋白在果实中的表达,并分别统计含外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的转基因番茄F0, F1, F2, F3代外源重组蛋白表达阳性率及总体表达阳性率。 2提取转基因番茄叶片和果实可溶性总蛋白,采用ELISA法检测外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB在转基因番茄叶片和果实的表达含量。 1)转基因番茄的培养及大田种植； 2)采样,植物开花坐果期每7d采集幼嫩叶片及果实样本； 3)BCA法分别测定转基因番茄果实样本和幼嫩叶片样本中可溶性总蛋白的含量； 4) ELISA法分别检测转基因番茄叶片和果实外源重组蛋白的浓度,并根据可溶性总 蛋白含量计算出外源重组蛋白含量百分比； 5)通过观察外源重组蛋白含量百分比的变化,研究以下内容： A.转基因番茄F0, F1, F2, F3代在相同时间外源重组蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB表达差异； B.转基因番茄叶片与果实中外源重组蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB的表达随转基因番茄植株生长的含量变化差异； C.单株转基因番茄坐果期不同果实在表达外源重组蛋白含量的差异。 结果： 1.提取的可溶性总蛋白经SDS-PAGE电泳分离出的蛋白条带,Western blot免疫印记杂交,曝光后证实该条带分子量约5.5×104KDa大小,与预计的外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的分子量相吻合； 2.提取的蛋白样品经Western blot检测,转基因番茄外植株中表达外源重组蛋白PAcA/CTB共有31株(F0代9株,F1代9株,F2代7株,F3代6株),转基因番茄外源重组蛋白PAcA/CTB表达阳性率为70.45%；表达外源重组蛋白PacP/CTB共有28株(F0代9株,F1代8株,F2代4株,F3代7株),转基因番茄外源重组蛋白PAcP/CTB表达阳性率为63.6%。转基因番茄外源重组蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB表达阳性率比较无统计学意义(P0.05)。 3.提取果实可溶性蛋白样本经BCA法测量可溶性总蛋白含量,ELISA检测外源重组蛋白含量,计算外源重组蛋白占可溶性总蛋白含量。同期外源重组蛋白表达含外源重组蛋白PAcA/CTB的转基因番茄F0代0.248%,F1代0.088%,F2代0.103%,F：；代0.078%；含外源重组蛋白PAcP/CTB的转基因番茄F0代0.308%,F,代0.300%,F2代0.278%,F3代0.176%。 4.番茄果实中外源重组蛋白均在开花坐果期的第6-8周达到最高。外源重组蛋白PAcA/CTB含量在6-8周分别为0.236%,0.276%,0.257%；外源重组蛋白PAcP/CTB含量在6-8周分别为0.568%,0.600%,0.554%。 5.单株转基因番茄坐果期成熟果实表达外源重组蛋白含量。A15果实外源重组蛋白表达含量水平分别为0.627%,0.467%,0.463%；A17果实外源在蛋白表达含量水平分别为0.379%,0.496%,0.233%；P区P15果实外源重组蛋白表达含量水平分别为0.580%,0.481%,0.758%；P19果实表达外源重组蛋白含量水平分别为0.498%,0.692%,0.597%。 结论： 1.在F0,F1,F2,F3代转基因番茄中均有植株的果实中成功表达了外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB。番茄中表达外源蛋白阳性率较高,转基因番茄外源蛋白的表达较为稳定。 2.在F0, F1, F2, F3代转基因番茄中,外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB表达含量均较高,在果实中外源重组蛋白PAcP/CTB表达效率高于外源重组蛋白PAcA/CTB的表达。 3.转基因番茄植株果实表达外源蛋白的效率高于叶片。 4.外源重组蛋白PAcP/CTB表达比重在坐果期均较表达外源蛋白PAcA/CTB植株更高；转基因番茄外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的表达同时在坐果期的6—8周达最高。 5.相同时间单株转基因番茄不同成熟果实,表达外源重组蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的含量比重均有差异。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R781.1
【图文】：

转基因番茄果实FigZThefrultsofTransgenietomato

2、 westernblot检测结果}蟹光图片结果显示，含有外源币组蛋白的转基因悉茄果实提取的蛋白样本在相对分子质员约为55KDa处出现了低密度条带(图3)

【引证文献】

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1 钱昱霏;刘建国;白国辉;管晓燕;韩琪;白朋元;;转基因番茄中外源目的蛋白提取液的筛选[J];遵义医学院学报;2013年02期

本文编号：2722017