流体剪切应力作用下力学信号在成骨细胞内的效应及分析

发布时间：2020-06-22 06:18

【摘要】：目的 观察分析不同流体剪切应力作用下力学信号在成骨细胞内的生物学效应。 方法 1.细胞培养:成骨细胞在DMEM完全培养液中常规条件下培养,细胞生长接近融合成单层时,0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA常规消化,制成细胞悬液,倒置相差显微镜下细胞计数,以10~4/ml细胞密度接种已处理好的载玻片置于CO_2孵箱(37℃,5%CO_2,95%空气)继续培养,每两天换一次液。 2.细胞成骨性能鉴定: (1)活体相差显微镜观察 (2)碱性磷酸酶(ALP)染色(采用改良钙钴法) (3)骨钙素(BGP)免疫组化染色(即用型SABC法) (4)矿化结节染色(茜素红染色和von Kossa染色) 3.细胞加力: 运用定常流加载系统,在完全密闭无菌的情况下对细胞玻片进行加力,蠕动泵可以调控液体流速,以控制流体剪切力。 4.观察分析不同流体剪切力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用不同时间(15min,30min,60min,120min)时,力学信号对成骨细胞形态及增殖能力的影响;并且对应力作用下成骨细胞内骨钙素阳性表达状况进行了初步分析。 (1)HE染色倒置相差显微镜观察展示细胞形态 (2)MTT法测定细胞增殖活性 (3)用Image-pro plus图像分析软件处理,对细胞面积及免疫组化染色结果进行半定量分析 结果 1.不同流体剪切应力作用对成骨细胞的形态学影响 (1)强度为7dynes/cm~2的流体剪切应力对成骨细胞形态及细胞面积的影响:与对照组比较,强度为7dynes/cm~2的流体剪切力作用15min、30min、60min、120min时细胞形态均有变化,细胞胞突及长轴摆动方向与应力方向趋于一致;本实验细胞面积测定结果显示:与对照组比较,强度为7dynes/cm~2的流体剪切力作用30min、60min、120min时细胞面积变化有统计学意义(P＜0.05),但作用15min时细胞面积变化无统计学意义(P＞0.05)。 (2)强度为12dynes/cm~2的流体剪切应力对成骨细胞形态及细胞面积的影响:与对照组比较,强度为12dynes/cm~2的流体剪切力作用15min、30min、60min时细胞形态均有变化,细胞胞突及长轴摆动方向与应力方向趋于一致;但本实验中观察到受力时间为120min时,细胞形态变化较异常,可观察到细胞核边集,呈现凋亡现象,细胞排列方向性不明显。本实验细胞平均面积测定结果显示:强度为12dynes/cm~2的流体剪切力作用60min和120min时细胞面积与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),而作用15min和30min与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05). (3)不同的流体剪切应力作用(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)对成骨细胞细胞面积影响的比较分析: 本实验细胞平均面积测定结果比较显示:两种不同强度的流体剪切力作用对细胞面积的影响差异有统计学意义(P＜0.05). 2.不同流体剪切应力作用对成骨细胞增殖活性的影响 (1)强度为7dynes/cm~2的流体剪切应力对成骨细胞增殖活性的影响: 本实验结果显示:与对照组比较,强度为7dynes/cm~2的流体剪切力作用15min、30min、60min时细胞的增殖活性差异均有统计学意义(P＜0.05);受力组间比较表明:受力60min时细胞的增殖活性最强(P＜0.05),而受力15min与30min时细胞增殖活性之间差异无统计学意义. (2)强度为12dynes/cm~2的流体剪切应力对成骨细胞增殖活性的影响: 本实验结果显示:与对照组(0min)对比,强度为12dynes/cm~2的流体剪切力作用15min、30min、60min时细胞的增殖活性差异均有统计学意义(P＜0.05);受力组间比较结果表明:受力60min时细胞的增殖活性明显提高(P＜0.05),而受力15min与30min时细胞的增殖活性差异无统计学意义. (3)不同的流体剪切应力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用对成骨细胞增殖活性影响的比较分析: 本实验结果显示:两种不同强度(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)的剪切应力作用对细胞增殖活性的影响差异有统计学意义(P＜0.05),其中12dynes/cm~2的流体剪切力作用60min时细胞的增殖活性最强。 3.强度为12dynes/cm~2的流体剪切应力作用不同时间对成骨细胞内BGP阳性表达的影响: 本实验结果显示:与对照组(0min)比较,强度为12dynes/cm~2的流体剪切力作用60min时细胞内BGP阳性表达差异有统计学意义(P＜0.05),具有明显促进细胞内BGP表达增加的作用;而作用15min和30min时细胞内BGP阳性表达差异均无统计学意义;受力组间比较显示:受力60min时细胞内BGP的阳性表达增高明显,与受力15min、30min相比差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 不同的流体剪切应力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用下力学信号均能引起成骨细胞内部发生效应性的变化,本研究结果表明了力学信号可引起成骨细胞形态、增殖活性及骨钙素表达等发生效应性改变,其中12dynes/cm~2的流体剪切应力作用60min具有较强的促成骨细胞增殖分化的能力。本实验结果将对第二阶段关于流体剪切应力下种植体细胞界面信号转导及其关键功能蛋白的研究起到铺垫和基础作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78
【图文】：

图1:MG一63细胞ALP染色:阳性细胞胞浆图2:MG一63细胞骨钙素(BGP)免疫组化检测:有黑色颗粒沉着(200又)(GomoriCa一Co)阳性细胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)图3:矿化结节染色茜素红染色，矿化结节呈图4:矿化结节vonkossa染色法染色，矿化深红色(10Ox)结节被硝酸银液染成黑色(IOOX).2.2正常MG-63的细胞形态

1.2.1成骨细胞性能检测成骨细胞株MG一63碱性磷酸酶(ALP)染色(见图l)，骨钙素(BGP)免疫组化染色(即用型SABC法)及矿化能力检测均呈阳性(见图2，3，4)。图1:MG一63细胞ALP染色:阳性细胞胞浆‘一卜奋汤.‘犷图2:MG一63细胞骨钙素(BGP)免疫组化检测:有黑色颗粒沉着(200又 )(GomoriCa一Co)阳性细胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)图3:矿化结节染色茜素红染色，矿化结节呈图4:矿化结节 vonkossa染色法染色，矿化深红色(10Ox)结节被硝酸银液染成黑色(IOOX)1.2.2正常MG-63的细胞形态在细胞爬片上随机选择视野清楚且形态清晰的视野，用倒置相差显微镜在20、10倍光镜下拍照，观察到正常未加力MG一63细胞有梭形、三角形、球形、纺锤形等多种不规则的形态，偶见癌巨细胞，多核细胞及多极分裂相细胞，核质比例较大

【参考文献】

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本文编号：2725314