牙髓干细胞形成牙体组织能力及其制备嵌合体牙齿的实验研究

发布时间：2020-06-22 12:39

【摘要】： 牙齿组织工程中局部诱导微环境的建立主要是通过支架材料或单因子诱导的方式,来促进牙髓干细胞的分化。由于牙齿发育的微环境异常复杂,涉及到上皮-间充质相互作用以及多种基质成分、矿物离子、生长因子的参与,单纯依靠支架材料或某几种生长因子等非生理诱导方式局限性较明显,不能满足组织工程化牙齿的形态发生要求。本研究拟通过模拟牙髓干细胞的体内生长发育环境,以重组微环境的方式来调控牙髓干细胞的分化和形态发生,并在此基础上,尝试利用牙髓干细胞研制同种异体“嵌合体牙齿”,以期为组织工程化牙齿最终的临床应用探寻一条新的研究途径。所取得的主要研究结果如下: 1组织工程化牙齿异位再生环境的筛选和验证比较了出生后4 d的封闭群SD仔鼠磨牙牙胚器官,在同种异体宿主体内不同部位的生长发育情况,结果表明肾被膜下的牙胚发育状况接近正常;进一步将相关的牙齿组织块移植至肾被膜下,同样生长发育良好;单独将牙乳头细胞团进行肾被膜下移植,可以形成牙尖样的牙本质牙髓复合体。另外,我们还比较了传代前、后的牙胚细胞团在肾被膜下构建组织工程化牙齿的可行性,结果表明:原代牙胚细胞团体内可发育成典型的牙胚样结构,而第二代牙胚细胞团仅形成极少量的釉质,覆盖在牙本质牙髓复合体表面。上述结果证实肾被膜下环境有利于牙胚及其相关组织、细胞的继续生长发育。在肾被膜下的生长环境中,出生后的牙乳头细胞、牙胚细胞可分别再现牙齿间充质、牙胚早期的发育模式,说明牙齿形态发生所需的遗传信息是储存在离散后的单个牙源性细胞中的。 2牙胚细胞诱导牙髓干细胞分化的实验为了验证牙胚细胞所提供的发育微环境是否适合成体牙髓干细胞的增殖、分化,本实验通过三种不同的培养方式:牙胚细胞条件液、分层培养、混合培养,观察牙胚细胞对牙髓干细胞生物学活性的影响。结果显示:牙髓干细胞在与牙胚细胞条件液培养、分层培养的情况下,可向功能性成牙本质细胞谱系分化,诱导分化后的牙髓干细胞团移植至肾被膜下,形成了规则的牙本质牙髓复合体结构。而牙胚细胞与牙髓干细胞混合培养方式不能提供了良好的促增殖、促分化的诱导环境,以致诱导后的牙髓干细胞不能形成典型的牙本质牙髓复合体。上述结果提示牙胚细胞与牙髓干细胞非接触式培养时,所提供的可溶性信号分子,有利于牙髓干细胞的牙向分化、牙本质形成;而接触式培养条件下牙胚细胞分泌的胞外基质蛋白以及不溶性表面分子,可能对牙髓干细胞的增殖起抑制作用,进而影响了其牙向分化的可持续性。 3牙髓细胞对牙髓干细胞增殖分化的影响为验证来自成体牙髓细胞的微环境能否促进牙髓干细胞的增殖、分化,本实验采用酶消化法结合组织块法,获取原代牙髓细胞,与STRO-1+的牙髓干细胞以三种方式:条件液、分层培养、混合培养进行共培养。结果表明:缺少上皮信号的成体微环境不能有效地诱导牙髓干细胞的牙向分化和形态发生,但可明显促进其增殖活性。提示成体微环境中缺少促进牙髓干细胞牙向分化的启动信号,但成体微环境中生长因子、细胞外基质以及细胞表面分子等对牙髓干细胞的促增殖效应明显。 4用牙髓干细胞制备嵌合体牙齿为进一步验证牙胚细胞的诱导作用是来自其中的上皮还是间充质成分,本实验将取自不同个体的大鼠切牙根尖蕾细胞、牙乳头细胞分别与STRO-1+牙髓干细胞复合形成细胞团重组体,肾被膜下移植,结果显示根尖蕾细胞-牙髓干细胞嵌合体在体内形成典型的牙冠样结构;牙乳头细胞-牙髓干细胞嵌合体形成的含骨样牙本质和牙本质牙髓复合体的结构中,PKH26标记的牙髓干细胞并未直接参与成牙本质细胞分化和牙本质形成,说明在牙胚细胞诱导牙髓干细胞牙向分化过程中,是牙源性上皮成分起了决定性作用。在与非牙源性STRO-1+骨髓基质干细胞嵌合成牙的比较研究中,我们发现:根尖蕾细胞能促进骨髓基质干细胞向成牙本质细胞谱系分化,但根尖蕾细胞-骨髓基质干细胞重组体在肾被膜下,仅发育成不典型的牙本质牙髓复合体,无釉质形成。提示在嵌合体牙齿研究中,牙源性成体干细胞比非牙源性成体干细胞更具有临床应用价值。当牙髓干细胞与根尖蕾细胞按不同比例进行体内重组时,我们发现:上皮细胞与牙髓干细胞的比例可影响嵌合体牙齿的形态发生,只有在1:1细胞比情况下,才会形成典型的牙冠样结构。综上所述,尽管不同的重组微环境对牙髓干细胞分化和形态发生的影响各不相同,但其规则的形态发生离不开牙源性上皮信号的诱导,从根本上讲,仍离不开上皮-间充质的相互作用。利用这一发现,本研究成功地用牙髓干细胞构建出嵌合体牙胚样结构。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R78
【图文】：

谱系,细胞团,牙本质

图 1.3.5 RT-PCR 检测 Dspp 基因的表达1，Marker；2，细胞团；3，单层细胞；4，β-actin；5，β-actin细胞团 DSPP（图 1.3.4C）、DMP-1（图 1.3.4D）免疫染色的细胞呈阴性表达（图 1.3.4E、F）。RT-PCR 显示细胞团表达，对照组则无表达（图 1.3.5）。究表明：细胞团培养时的三维立体环境，可促进牙乳头细胞谱系分化，但由于细胞团内部营养不足，细胞增殖极慢。因胞团如用于体内移植实验时，其体外培养时间不宜超过3 组织学分析植物取材结果显示：对照组的牙乳头组织分化形成了典型的体，牙本质小管、髓腔结构清晰（图1.3.6C、D）。实验组有m×2 mm×2 mm（图1.3.6A、B）、牙尖样的牙本质牙髓复合E、G），这些移植物中成牙本质细胞、前期牙本质、牙本质

细胞周期,细胞

第四军医大学博士学位论文传代1次。用TGC条件液诱导4 d后，原本多形态分布的DPSC呈现柱状伸长现象，有长的细胞突起，趋于平行排列，个别细胞有单个胞浆突起（图2.1.1B）。7d时，出现更多的长梭形紧密排列的细胞（图2.1.1D）。对照组细胞常规培养7 d没有明显的形态学改变（图2.1.1C）。B

【参考文献】