自体PRP对钛表面成骨细胞增殖的影响及PDGF的变化

发布时间：2020-06-28 08:59

【摘要】：目的：本研究采用体外实验，建立细胞与钛片复合培养的体外培养模型，将由兔全血所制备的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)作用于其自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，通过对钛片表面细胞数量及形态各项指标的检测，探讨不同浓度的自体PRP在不同时间段对钛片表面BMSCs增殖的影响以及血小板源性生长因子（PDGF）浓度的变化，进一步揭示PRP的作用机制，为临床根据生理和病理的需要，选择合适浓度的PDGF和PRP以及合理的应用时间提供实验依据。方法：①BMSCs的培养：应用全骨髓培养法取兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行原代培养，具体方法如下：将2-3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，在腿部胫骨平台处以16~#骨髓穿刺针垂直骨面，旋转进入骨髓腔，抽取4-6ml骨髓接种于培养瓶，待细胞达到90％融合时予以传代，用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线：于1-10d每天将接种于24孔板的第3代BMSCs各取3孔，酶消法消化后显微镜下计数，绘制细胞生长曲线。③钛片的处理：将实验用直径10mm，厚度1mm已打磨光滑的圆形钛片依次用丙酮、无水乙醇、75%乙醇及双蒸水各超声清洗20min，高温高压消毒30min，无菌保存备用。④PRP的制备：采用二次离心法分离兔全血获得PRP，仪器计数法比较全血与PRP中的血小板数目。具体步骤是，方法同上麻醉实验动物，从颈动脉处抽取所有全血约120ml，第一次先以1100r/min速度水平离心机室温离心10min，吸取全部上清及红细胞液面下2-3mm，再以2200r/min的速度离心10min，弃2/3上清，所剩1/3液体即为PRP，以牛凝血酶激活后2小时内加入到细胞培养系中。⑤PRP作用于BMSCs：将配制的含不同浓度PRP(0%、10％、20％、30％)的诱导培养液作用于生长良好的已在钛片表面适应性生长24h的第4代BMSCs，每孔设3复孔，另设空白对照组。⑥成骨细胞鉴定：取第3代BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，以碱性磷酸酶染色法及钙结节染色法验证其成骨分化能力。⑦MTT法检测增殖：分别在第1、4、7、10d取各孔实验组，弃去孔内培养液，清洗后加入MTT试剂于钛片上，37℃孵育4h，再加入二甲基亚砜，结晶均匀溶解后在酶标仪上测各标本的OD值。⑧ELISA法测PDGF-AB浓度：分别在第0、1、2、3、4d取各钛片组细胞的上清液，根据兔ELISA试剂盒说明检测各标本中PDGF-AB的OD值，并在标准曲线上获得PDGF-AB浓度。⑨荧光染色观察钛片表面细胞形态：在第4、7、10d取出各实验组钛片，固定后以荧光染色剂F-actin对细胞骨架进行荧光染色，再以DAPI最后复染细胞核，正置荧光显微镜下观察。结果：①倒置显微镜下细胞形态：原代BMSCs呈短梭形，至12d左右可达到80％融合，此时细胞形态为均一的长梭形，漩涡状排列，传代后的细胞形态比原代细胞更为均一，增殖迅速。根据生长曲线图可知，传代培养潜伏期一般为2-3d，4-8d为对数生长期，9-10d增殖趋于稳定，达到平台期，细胞增殖趋于平缓。②成骨能力鉴定：经成骨诱导后，碱性磷酸酶染色结果示细胞胞浆中出现红棕色、棕褐色或咖啡色颗粒，钙结节染色示结节处有橘红色钙盐沉积，即为钙化结节，均呈阳性表达，表明所培养的BMSCs具备成骨分化能力，为成骨细胞。③PRP的检测：采用二次离心法得到的PRP中血小板数目为864±37×109/ml，是全血201±26×109/ml的4.3倍。PRP经激活后，析出的上清液经兔ELISA试剂盒检测PDGF-AB值在标准曲线上能获得值为95.537±5.112ng/ml，二次离心法制备的PRP中含有高浓度的生长因子PDGF-AB。④MTT检测增殖结果：20％PRP组第7d时OD值最高，在第4d20%＞30%＞10%，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7-10d，20%＞10%＞30%，差异有统计学意义（P＜0.05）；0%对照组各时间点间无明显变化。因此增殖作用与PRP存在时间和浓度效应，20%为最佳作用浓度。⑤PDGF-AB浓度变化：PDGF-AB值总体趋势逐渐下降，受自分泌及旁分泌影响稍有波动，但前3d仍能维持较高浓度。第4天生长因子大量衰减，即表明该因子的有效作用时间为前3天。⑥荧光染色结果示：细胞核呈蓝色，圆形或椭圆形，细胞骨架呈绿色，形态不规则，多角形，可见突起，包绕在细胞核周围，符合成骨细胞形态。结论：①本实验中各浓度(10％、20％、30％)PRP均能有效地促进BMSCs的增殖，其中20％PRP为最佳浓度。②二次离心法制备的PRP中含有高浓度的生长因子PDGF-AB，在PRP20％浓度时PDGF-AB所对应值为18.66-24.30ng/ml，为该因子作用于成骨细胞的最佳浓度范围。③PRP中生长因子PDGF-AB半衰期较短，前3天为最佳作用时间。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2

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