氟离子注入钛表面对骨细胞相容性和抗菌性能的影响

发布时间：2020-06-29 22:26

【摘要】： 目的牙种植体作为植入体内的医用装置,已成为修复牙列缺损和牙列缺失的主要治疗手段之一。种植材料的表面性状和形态可影响种植后的生存质量,决定组织细胞在其表面的粘附、增殖和分化,对种植体的初期稳定性和远期固持率发挥十分重要的作用。钛以其优良的生物相容性、力学性能、耐腐蚀性和良好的可加工性在牙种植领域中得以广泛应用。但是钛也有它自身的缺点。钛基本属于生物惰性材料,不能与骨组织形成生物性结合从而获得理想的骨整合,同时钛自身不具备抗菌性能,在植入及修复后易出现菌斑堆积于钛种植体周围。为解决这一问题,许多学者利用表面改性技术,对金属钛表面进行活化处理,赋予金属材料生物功能性,在获得骨整合方面取得了理想的效果。然而针对提高种植材料抗菌性能的研究却相对较少。大量统计结果证实,临床上种植体的松动、脱落,相当一部分原因是由于种植体颈部菌斑堆积,致病菌通过其菌体表面物质、产生的毒素及代谢产物等破坏种植体周围软组织封闭屏障以及骨性结合界面,导致种植体周围炎并最终出现骨性结合界面丧失,种植失败。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的种植体周围炎的主要可疑致病菌之一,因此,对牙龈卟啉单胞菌粘附和增殖的控制是预防种植体周围炎的关键。种植材料对成骨细胞行为的影响是多层面的。在细胞水平上,它可以影响细胞的形态、粘附、增殖、迁移和分化等;在分子水平上,它可以影响细胞的骨相关基因的表达。有很多研究已经证实植入材料的表面化学成分、表面物理形貌都会对成骨细胞的生物学行为产生影响。在评估种植材料的生物活性时,一个重要指标就是观察改性材料是否能促进组织细胞在其表面早期大量附着并形成良好的细胞形态,形态上的变化是启动一系列细胞行为的生物信号。成骨细胞在种植材料表面的早期粘附和增殖是成骨细胞进一步分泌细胞外基质、合成相关蛋白、矿化成骨及表达成骨细胞生物合成功能的基础。细胞的粘附过程和细胞的信号传导通路有关,粘着斑的形成是成熟细胞信号传导的前提。整合素与细胞外基质结合,再与粘着斑形成复合物,传导细胞外基质以及生长因子的信号,引起细胞骨架的变化,继而引起细胞的形态及一系列功能变化。Ⅰ型胶原是骨组织中最重要的分子标记,因而检测Ⅰ型胶原的形成和表达可作为生物材料生物学潜能的判断依据。在生物陶瓷涂层众多问题尚未解决的情况下,利用离子注入技术改变钛种植体表面的物理形貌和化学状态以提高其生物相容性成为目前研究的热点。等离子体浸没离子注入技术作为一种全方位的离子注入技术,近年来受到国内外学者的广泛重视并逐渐应用于生物学领域。氟作为机体生命活动所必须的微量元素之一,对全身骨骼生长发育和维持骨骼生理结构功能具有重要作用。同时,氟化物具有良好的抗菌性能。本实验应用等离子体浸没离子注入技术,将氟离子引入光滑商业纯钛表面,并通过微观分析方法,对其表面的化学组成和物理结构进行综合评价。将牙龈卟啉单胞菌和成骨细胞分别接种于氟离子注入纯钛前后的材料表面,建立细菌与材料界面间、细胞与材料界面间的直接接触关系,综合评价通过等离子体浸没离子注入技术对纯钛表面进行氟离子注入后改性材料的抗菌性能及其对成骨细胞生物学行为的影响,为探索同时具有良好的生物相容性和抗菌性能的种植材料提供一种具有应用前景的材料改性方法。方法一、氟离子注入钛表面及其微观分析 1、氟离子注入纯钛表面改性材料的制备将商业纯钛基体材料加工成直径为10mm、厚度为1mm的钛片,表面经机械研磨、抛光至镜面后将其分为两组,进行氟离子注入的钛片为实验组,未进行氟离子注入的钛片为对照组。应用哈尔滨工业大学现代焊接生产技术国家重点实验室自主研发的第三代等离子体浸没离子注入装置进行氟离子注入,CF4为离子注入源。 2、化学组成和物理形貌的分析应用PHI-5700 ESCA型X线光电子能谱分析系统进行改性材料表面化学元素组成的分析,并通过高斯拟合显示各元素的化学状态;应用扫描电镜观察氟离子注入前后材料表面物理形貌的变化。 3、氟离子释放浓度的测定采用氟离子选择电极法测量不同氟离子注入时间的改性材料样品单位时间内释放的氟离子浓度。二、氟离子注入钛表面改性材料的抗菌性能 1、抑菌实验采用改性材料表面直接细菌培养法,通过倍比稀释各样本后接种培养,菌落计数观察氟离子注入前后钛片表面对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用。 2、牙龈卟啉单胞菌的扫描电镜观察应用扫描电镜观察牙龈卟啉单胞菌在氟离子注入前后钛片表面的形态变化。三、氟离子注入钛表面改性材料对成骨细胞生物学行为的影响 (一)细胞毒实验将成骨样细胞MG-63制成5×10~3 cells/ml的细胞悬液,接种于96孔板中,细胞贴壁后,以改性材料浸提液替换原培养液。分别培养24小时、48小时、72小时后,MTT法检测改性材料对成骨细胞增殖的影响。 (二)成骨细胞粘附和增殖实验 1、扫描电镜通过扫描电镜观察MG-63在氟离子注入前后钛片表面的形态变化。 2、丫啶橙染色丫啶橙染色法检测MG-63在氟离子注入前后钛片表面粘附和增殖的数量。 3、PI单染法流式细胞仪应用PI单染法流式细胞仪分析MG-63在氟离子注入前后钛片表面的细胞周期变化。 (三)成骨细胞粘着斑形成的测定接种到氟离子注入前后钛片表面的MG-63分别培养6小时、24小时、48小时后,应用免疫荧光法观察氟离子注入纯钛改性材料表面MG-63粘着斑的形成,激光共聚焦显微镜观察并摄片,测量细胞荧光强度,计数粘着斑形成数量。 (四)、成骨细胞Ⅰ型胶原形成和表达的测定 1、免疫荧光法检测Ⅰ型胶原的形成接种到氟离子注入前后钛片表面的MG-63分别培养6小时、24小时、48小时后,应用免疫荧光法观察MG-63Ⅰ型胶原的形成,激光共聚焦显微镜观察并摄片,测量细胞荧光强度,计数Ⅰ型胶原形成的数量。 2、逆转录聚合酶链反应检测Ⅰ型胶原mRNA的表达接种到氟离子注入前后钛片表面的MG-63分别培养6小时、24小时、48小时后,收集细胞,提取并检测总RNA,合成第一链cDNA,PCR扩增Ⅰ型胶原和β-actin,琼脂糖凝胶电泳分析改性材料对Ⅰ型胶原mRNA的表达的影响。 3、蛋白印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达接种到氟离子注入前后钛片表面的MG-63分别培养6小时、24小时、48小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白并定量,SDS凝胶电泳,转膜并封闭后,抗原抗体杂交孵育,显色后凝胶成像仪分析改性材料对Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。结果一、氟离子注入钛表面改性材料的微观分析 1、改性层的化学组成 XPS宽程扫描分析显示,氟离子注入后材料表面主要为钛、氧、氟、碳四种元素,比纯钛表面新增了氟元素的信号,且随着氟离子注入时间的增加氟信号逐渐增强,钛的信号也随之增强,氧信号因逐渐被增强的氟信号所掩盖而减弱。高斯拟合结果显示氟离子注入前样品表面的Ti2p3/2峰位置在458.5eV处,可归结为二氧化钛;注入后样品表面在约458.7eV及459.9eV处都出现Ti2p3/2峰,分别归结为二氧化钛及三氟化钛。 2、改性层的表面形貌氟离子注入后,材料表面形成许多均匀分布的、散在的团粒状物质,大部分嵌入基体组织中,少量突出于材料表面,并且随着氟离子注入时间的延长,沉积于改性层表面的团粒数量逐渐增多,且团粒之间有大小较均匀的孔隙存在。从20000倍扫描电镜照片可以看出,氟离子注入7小时组表面沉积的团粒大小和形状更加均匀一致,边界更加清晰。 3、氟离子释放材料氟离子的释放小于0.10mg/L的检出极限。二、氟离子注入钛表面改性材料对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用 1、菌落计数氟离子注入组钛片表面牙龈卟啉单胞菌菌落的数量明显少于纯钛表面,具有显著性差异(P＜0.01);且随着氟离子注入时间的延长,其表面的菌落数量减少明显,除F-Ti-5h组与F-Ti-7h组外(P＜0.05),不同氟离子注入时间的各组之间具有显著性差异(P＜0.01)。 2、氟离子注入钛表面对牙龈卟啉单胞菌粘附和菌体形态的影响在纯钛表面粘附的牙龈卟啉单胞菌数量较多,菌细胞分散且大多为单个生长,菌细胞形态规则,边缘光滑呈球杆状,为正常菌体形态;而氟离子注入后,改性材料表面牙龈卟啉单胞菌粘附的数量较纯钛表面减少且出现菌细胞形态变异。三、氟离子注入钛表面改性材料对成骨细胞生物学行为的影响 (一)MTT法分析结果氟离子注入组钛片表面成骨样细胞MG-63的细胞增殖数量明显多于对照组纯钛表面,具有显著性差异(P＜0.01);并且随着氟离子注入时间的延长增殖数量明显增多,不同氟离子注入时间的各组之间具有显著性差异(P＜0.01)。但培养72小时后,F-Ti-7h样品表面的细胞增殖数量则与F-Ti-Sh之间无统计学意义(P＞0.05)。 (二)改性材料对成骨细胞粘附和增殖的影响 1、扫描电镜观察细胞形态纯钛表面MG-63大多为多边形或圆形,伸展不十分良好。氟离子注入钛表面的成骨细胞伸展良好,以多个细长的突起牢固的粘附于基底材料的表面,并且,随着氟离子注入时间的延长,钛片表面成骨细胞的密度有增加的趋势,伸出细长的伪足与周边的细胞形成良好的交通。 2、细胞的粘附与增殖所有材料表面粘附和增殖的MG-63细胞数随培养时间的延长而增加。培养后6小时,各组材料表面细胞数量无统计学意义(P＞0.05)。培养至24小时后,氟离子注入纯钛组表面的细胞数比未注入的纯钛组多,具有统计学意义(P＜0.05);但是F-Ti-7h样品表面的细胞粘附数量与F-Ti-5h之间无统计学意义(P＞0.05)。 3、流式细胞仪分析细胞周期 MG-63细胞接种48小时后,氟离子注入组与未注入组表面细胞的G_0/G_1和G_2/M期的比例无统计学意义(P＞0.05)。氟离子注入组细胞S期的比例明显高于未注入之纯钛组,且随着氟离子注入时间的增加而增加(P＜0.05)。在DNA直方图上,在G1峰前未出现凋亡峰。 (三)改性材料表面成骨细胞粘着斑的形成氟离子注入前后钛片表面MG-63的细胞膜上均可见绿色点状或簇状的纽蛋白荧光染色。定量对比显示,粘着斑形成的数量随培养时间的延长逐渐增加;培养6小时后,氟离子注入组材料表面的粘着斑形成数量比纯钛组表面形成的多,差异有统计学意义(P＜0.05);培养至24小时后,两种材料表面均有大量的粘着斑形成,差异无统计学意义(P＞0.05)。 (四)改性材料表面成骨细胞Ⅰ型胶原的形成和表达 1、成骨细胞Ⅰ型胶原的形成材料表面Ⅰ型胶原形成的数量随培养时间的延长逐渐增加。荧光强度的定量对比显示,培养6小时、24小时后,氟离子注入组材料表面的Ⅰ型胶原蛋白形成数量明显多于纯钛组表面,有显著性差异(P＜0.01);48小时后,氟离子注入组材料表面的Ⅰ型胶原蛋白形成数量比纯钛组表面多,差异有统计学意义(P＜0.05)。 2、材料表面成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达两组材料表面Ⅰ型胶原mRNA表达均为阳性。随着培养时间的延长,两组材料表面成骨细胞分泌的Ⅰ型胶原mRNA量均逐渐增加,且氟离子注入组材料表面的Ⅰ型胶原mRNA表达较纯钛组表面的多,差异有统计学意义(P＜0.05)。 3、材料表面成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达两组材料表面培养均能检测到Ⅰ型胶原蛋白的表达,随着培养时间的延长,两组材料表面成骨细胞分泌的Ⅰ型胶原蛋白量均逐渐增加,且氟离子注入组材料表面的Ⅰ型胶原蛋白表达较纯钛组表面的多,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 1、氟离子注入纯钛后,其表面化学元素主要为氧、钛、氟和碳;其化学组成主要为二氧化钛和三氟化钛。 2、氟离子注入后,材料表面形成许多均匀分布的、散在的团粒状物质。 3、氟离子释放量低于0.10mg/L的检出极限。 4、氟离子注入纯钛表面改性材料具有抑制P.g生长的性能。 5、氟离子注入纯钛表面改性材料可抑制P.g的粘附并影响其菌体形态。 6、氟离子注入纯钛表面改性材料没有细胞毒性。 7、氟离子注入纯钛表面改性材料利于成骨细胞在其表面的粘附和增殖。 8、氟离子注入组材料表面成骨细胞粘着斑形成的数量明显多于纯钛组,差异有统计学意义。 9、氟离子注入组材料表面成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白形成的数量明显多于纯钛组,差异有统计学意义。 10、氟离子注入组材料表面材料成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA和Ⅰ型胶原蛋白的表达明显高于纯钛组表面,差异有显著性。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R783.1
【图文】：

离子注入装置

3、实验设备离子注入装置为哈尔滨工业大学现代焊接生产技术国家重点实验室自主研发的第三代等离子体浸没离子注入装置，见图1。xPS分析仪为PHI一 5700ESCA型X线光电子能谱分析系统。扫描电镜为JSM一300型扫描电镜。氟离子选择电极及PHS一3型数显酸度计。

照片,氟离子,照片,微小裂隙

氟离子注入后材料表面仍然有微小裂隙的存在，裂隙数量与氟离子注入前未见明显变化。从 20000倍扫描电镜照片可以看出，氟离子注入7小时组表面沉积的团粒大小和形状更加均匀一致，边界更加清晰。见图4。三、氟离子释放本实验条件下，材料氟离子的释放小于0.10mg/L的检出极限。

【引证文献】