Quaking促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的作用

发布时间：2020-06-30 16:59

【摘要】：1.QKI促进hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化研究目的:人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)是一种间充质来源的干细胞,具有自我更新的能力,并能够在特定的环境下分化为具有特定功能的细胞群体,形成修复性牙本质来防御或自我修复。Quaking(QKI)是信号转导及RNA活化蛋白(Signal Transduction and Activator of RNA metabolism,STAR)家族的一员。作为一种RNA结合蛋白,QKI蛋白可以通过结合在靶定的目标RNA上发挥作用。研究证明,QKI在多种生理或病理进程中都发挥重要作用。QKI在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞(odontoblast-likecells,OLCs)分化过程中的作用还未见报道。本研究试图探讨RNA结合蛋白QKI在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化(简称成牙本质细胞向分化)中的表达及作用。研究方法:本研究利用免疫组化检测PN2小鼠下颌切牙中QKI蛋白的表达模式。我们在体外分离培养hDPSCs,并对细胞干性进行了鉴定。在模拟hDPSCs成牙本质细胞向分化的过程中,提取不同天数的RNA和蛋白,通过qRT-PCR和Western blot检测QKI及其他分化相关基因的表达。同时,我们利用免疫组化检测了 QKI蛋白在成牙本质细胞向分化过程中的定位表达。为了探索QKI在hDPSCs成牙本质细胞向分化中的功能,分别在hDPSCs中过表达或抑制QKI,并通过qRT-PCR和Western blot检测其在细胞分化过程中标志性基因的表达水平,同时通过检测碱性磷酸酶活性和矿化结节的形成来验证QKI对hDPSCs成牙本质细胞向分化功能的影响。研究结果:PN2小鼠下颌切牙模型显示QKI在前成牙本质细胞中低表达,而在分化后的成牙本质细胞中表达较高。在体外人牙髓干细胞诱导分化过程中,QKI表达表现为先上升再下降,但都高于未分化水平。免疫荧光显示,诱导分化后,QKI蛋白表达明显增强,且主要表达在诱导后成牙本质细胞样细胞的胞核内,胞浆亦有少量表达。过表达QKI可上调DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平,并可促进矿化结节的形成;沉默QKI表达可下调DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平。结论:RNA结合蛋白QKI在hDPSCs中表达并在向成牙本质细胞样细胞分化过程中表达上调,并可以促进hDPSCs成牙本质细胞向分化。2.QKI作为KLF4的ceRNA促进hDPSCs成牙本质细胞向分化研究目的:在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化过程中,有多种分子机制参与调控,包括生长因子,转录因子,microRNA和其他信号通路等,这些分子相互联系形成网络并从不同层面上调节hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化。CeRNA即竞争性内源RNA,为来源于生物体内部的编码或非编码RNA,通过自身的MRE与相关的microRNA结合,从而竞争性的对受共同microRNA调控的其他靶基因进行调控,在细胞增殖分化和疾病发生中有着重要作用。本研究探究了QKI mRNA在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化过程中与转录因子KLF4 mRNA相互作用产生的ceRNA调控网络及其功能。研究方法:利用qRT-PCR与Western blot检测hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化过程中QKI和KLF4的表达趋势。分别抑制QKI与KLF4的表达水平,检测两者mRNA水平及蛋白水平表达的变化。利用生物信息学方法预测在人类基因组中KLF4和QKI mRNA是否存在互为ceRNA的可能性,并筛选出它们可能共享的miRNAs。在hDPSCs中过表达这些miRNAs,Western blot检测QKI和KLF4蛋白的表达,并利用双荧光素酶报告实验验证共享的miRNAs与QKI和KLF4确实能够结合。最后,利用双荧光素酶报告实验验证QKI和KLF4之间的调控关系具有miRNA依赖性。研究结果:QKI和KLF4在hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化中具有相同的表达模式。抑制QKI的表达能够显著下调KLF4的表达水平,反之亦然。生物信息学预测QKI和KLF4共享的miRNA,通过Western blot和荧光素酶活性实验证明,mir-124-3p,mir-128-3p,mir-145-5p和mir-429可以同时结合QKI和KLF4的3'-UTR区并抑制其表达。下调QKI的表达能够显著抑制KLF43'-UTR区的荧光素酶活性,同样下调KLF4的表达能够显著抑制QKI3'-UTR区荧光素酶活性,而当突变这些共享miRNA的结合位点时,这种调控作用消失。结论:QKI mRNA和KLF4 mRNA互为ceRNA,通过竞争性的结合mir-124-3p,mir-128-3p,mir-145-5p和mir-429促进hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化。3.QKI作为RNA结合蛋白促进hDPSCs成牙本质细胞向分化研究目的:QKI蛋白属于信号转导及RNA活化蛋白家族,是一种在进化上高度保守的RNA结合蛋白,主要发挥调节RNA代谢和信号转导的功能。QKI可以通过结合于pre-mRNA或成熟mRNA上发挥作用,在促进细胞的分化中起到重要的作用,同时也会影响人类疾病的发生发展。本研究旨在探索QKI除作为KLF4的ceRNA发挥作用外,是否可以通过RNA结合蛋白相关的调控机制,促进hDPSCs向成牙本质细胞样细胞的分化过程。研究方法:利用生物信息学方法,预测在人类基因组中成牙本质细胞样细胞分化关键基因上是否存在QKI蛋白的结合位点。利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验检测QKI和DSPPmRNA能否直接结合。利用siRNA抑制QKI的表达并加入放线菌素D抑制细胞内mRNA的转录,qRT-PCR检测DSPPmRNA的半衰期。研究结果:生物信息学分析了 Collagen I、SIBLING家族等成牙本质细胞分化相关基因,发现在DSPPmRNA蛋白编码区上存在QKI的结合位点,并且通过RIP实验证明QKI蛋白可以富集DSPP mRNA。半衰期实验证实QKI结合于DSPPmRNA后,可以增强其稳定性,间接增加DSP蛋白的表达。结论:QKI蛋白可以结合于DSPPmRNA的蛋白编码区并增强其稳定性,发挥其RNA结合蛋白的功能,促进hDPSCs向成牙本质细胞样细胞分化。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R78
【图文】：

Ｑｕａｋｉｎｇ促进人牙毮丨＇－细胞成牙木质向分化的作ＩＩＪ逦逡逑此外，还有研宄证明ＱＫＩ蛋白可以通过改变与内吞溶酶体形成和降解相关的蛋白逡逑ＲＮＡ稳态，改变内吞溶酶体的数量，对胶质干细胞千性的维持产生作用（Ｓｈｉｎｇｕｅｔ逡逑ｌ．，２０１７）。逡逑ｕｃ

图１－１．邋ｈＤＰＳＣｓ鉴定

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1 李舒晨;Quaking促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的作用[D];武汉大学;2018年

本文编号：2735562