IBP（IRF-4结合蛋白）在人涎腺腺样囊性癌中表达及功能的实验研究

发布时间：2020-07-03 04:04

【摘要】：腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一,常好发于小涎腺。该肿瘤起病隐蔽,生长缓慢,侵袭性强,易复发、易早期转移,且对常规的化疗、放疗等治疗措施不敏感,因其有沿着周围组织的神经血管潜行性生长的特点,而确切定位神经受侵部位尚无客观手段,从而给临床手术完全切除肿瘤带来较大困难。切除范围不足时,术后易复发;而盲目扩大切除,必然给患者带来不必要的畸形和功能障碍。因而综合治疗效果和远期疗效均不理想。随着基因治疗的兴起,深入研究涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,sacc)的生物学特性,从基因和蛋白水平来探讨SACC的发生机制,寻找与SACC的发生、发展和预后相关的生物学标记成为国内外研究的热点,基因治疗也成为未来最具潜力的有效根治SACC的方法。 IBP(IRF-4 binding protein, IRF-4结合蛋白)是一种主要表达于T淋巴细胞并具有重要功能的蛋白质。它参与TCR信号刺激下T细胞免疫突触的形成;与Th2细胞的分化密切相关;通过抑制IRF-4的转录因子活性调控介素17与介素21的产生,影响Th17细胞的功能;影响MAPKs与NF-κB参与TLRs传导通路;在维持免疫内环境的稳定中发挥重要作用。IBP knockout小鼠表现为自身免疫免疫性疾病的症状。另外,IBP具有GEF(鸟苷酸交换因子)的作用,能够激活Rho GTPase家族的部分成员。以上这些研究结果均提示IBP可以参与细胞骨架的重构、细胞极化、细胞间的信息传递等多种重要的生理过程。近来有学者发现IBP在结肠癌及乳腺癌中高表达并起着重要的作用。但IBP在SACC中的表达及功能还未见报道。本课题首次以SACC为研究对象,对IBP在SACC和正常涎腺中的表达及其可能的临床意义进行研究,并建立了稳定高表达IBP的SACC细胞株,通过体外试验证实IBP在SACC中的功能及其可能的机制。主要研究内容和结果: 一、IBP在SACC和正常涎腺中的表达及其临床意义的研究 1、利用ACC2、ACCM等2株SACC细胞株通过Western Blot技术检测IBP的表达情况;结果显示:IBP在ACC2、ACCM细胞株中均阴性表达。 2、收集了27例SACC石蜡标本和20例正常涎腺组织标本,通过免疫组化染色对IBP在临床样本中的表达情况进行分析,并将其与临床样本的其它病理学指标进行统计学分析确定其临床意义;结果表明:27例SACC中仅3例IBP基因表达弱阳性,20例正常涎腺组织中则全部表达阳性,两组间存在显著性差异(P0.05)。而IBP的表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位均无明显的相关性(P0.05)。二、IBP在SACC中的功能及其机制的研究 1、利用IBP阴性表达的ACC2细胞,通过质粒转染构建IBP过表达细胞模型;通过Western Blot检测证实获取了稳定高表达IBP的ACC2-C1/IBP细胞株。 2、通过MTT法检测各组细胞增殖情况,确定IBP对细胞增殖的影响;结果表明:IBP抑制SACC细胞的增殖。 3、通过平板克隆形成试验,检测IBP对ACC2细胞克隆形成能力的影响;结果证实:IBP能抑制SACC细胞的克隆形成能力。 4、采用Transwell试验,将穿膜细胞进行染色计数分析各组细胞侵袭能力的变化,明确IBP对细胞侵袭能力的影响;结果表明:IBP有促进SACC细胞侵袭的作用。 5、通过临床常用的SACC治疗药物紫杉醇为诱导剂,观察IBP的表达对SACC细胞耐受紫杉醇杀伤能力的影响;结果提示:IBP在一定程度上还具有紫杉醇抗药性。 6、利用微管蛋白Tubulin免疫荧光染色,观察IBP与微管的关系,并观察紫杉醇作用前后微管的变化;结果表明:IBP与微管有一定程度的共定位,并能促进微管的解聚。 7、通过波形蛋白和角蛋白的免疫荧光染色,初步探讨了IBP与EMT的关系;初步证实了IBP能够促进上皮间质转化的发生。综上所述, IBP在正常涎腺中存在高表达,在SACC中则低表达甚至不表达;SACC中IBP的表达具有抑制增殖、促进侵袭的作用,并对紫杉醇耐药,能够促进上皮间质转化的发生。上述研究成果能为临床SACC的的诊断和治疗提供新的靶点及方向,并对临床化疗用药的选择具有指导意义。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.8
【图文】：

二甲苯,乙醇,细胞株,检测鉴定

第三军医大学硕士学位论文水透明：50%乙醇，1min→70%乙醇，1min→90%乙醇，1min→无水乙乙醇，2min→二甲苯/无水乙醇(1：1)，5min→二甲苯，5min→二甲苯封片。BS 代替一抗作为阴性对照。镜观察并拍照，采用 χ2检验分析 IBP 的表达与 SACC 相关参数的结果SACC 细胞株 IBP 表达的 WB 检测鉴定 ACC2、ACCM 细胞株的 IBP 表达情况，分别提取细胞株 ACC照人白血病细胞株 Jurkat 的总蛋白，利用 Western blot 检测 IBP 的测，确认 ACC2、ACCM 细胞中未见 IBP 的表达(如图 1 所示)。

腺样囊性癌

IBP在正常涎腺组织和腺样囊性癌中的表达(S-P×40)

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