基因转染成纤维细胞构建组织工程化牙本质的研究

发布时间：2020-07-06 14:57

【摘要】： 组织工程学的发展为组织缺损的修复以及器官的重建再造开辟了一条崭新的道路,构建组织工程化组织的研究是目前口腔颌面整形领域关注的热点之一。由于牙齿对于颌面骨的生长发育,对于维持颌面部的美观,对于语言、咀嚼功能有着重要的作用,许多国家试图利用组织工程学技术构建组织工程化牙齿。牙本质是构成牙齿的主体,在组织工程化牙齿的形成过程中牙本质的构建是一个关键。本研究对构建组织工程化牙本质的种子细胞、生物支架材料、组织工程化牙本质构建等方面进行了探讨。 目的:利用基因转染技术对来源广泛易于获得和培养的口腔粘膜成纤维细胞进行牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1, DMP1)基因转染,获得牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞(dentin matrix protein1-porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF),通过对牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞生物学性能、成牙本质细胞特异性基因蛋白表达的观察,探讨构建组织工程化牙本质的种子细胞。 利用建立的组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞,DMP1-POMF)复合脱细胞真皮基质进行培养,通过HE染色光镜观察、扫描电镜观察、流式细胞检测探讨DMP1-POMF种子细胞与脱细胞真皮基质的相容性,评价脱细胞真皮基质作为构建组织工程化牙本质支架材料的可行性;通过裸鼠肌肉内植入DMP1-POMF复合脱细胞真皮基质支架材料,观察其在动物体内的生长、组织学结构的变化、牙本质特异性基因蛋白的表达,探讨组织工程化牙本质的构建。 对建立的组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞,DMP1-POMF)进行细胞团三维立体培养,通过细胞形态学观察、蛋白表达定量分析,评价细胞团内DMP1-POMF细胞的生物学特性和成牙本质细胞特异性基因蛋白的表达;通过DMP1-POMF细胞团体内盖髓的组织学及免疫组织化学检测,评价组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞,DMP1-POMF)细胞团三维立体培养在修复牙本质缺损中的作用。 方法: 1 pEGFP-DMP1基因真核表达质粒的构建。参照2006年3月Kim J等发表的猪DMP1全基因序列,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成并构建了重组绿色荧光融合蛋白pEGFP-DMP1质粒。 重组质粒经扩增提取后用XhoI和EcoRI双酶切,产物进行琼脂糖凝胶电泳。确定后对全基因序列进行测序检测。 2细胞培养及牙本质基质蛋白1(DMP1)基因转染 2.1猪口腔粘膜成纤维细胞的原代培养及来源鉴定 中国农业大学实验动物研究所购买10月龄中国实验小型猪,3%戊巴比妥钠耳后肌肉麻醉,无菌条件下留取颊粘膜固有层结缔组织标本,置含抗生素预冷DMEM培养液中,剪成约1mm3的小块,在含10% FBS的DMEM,37℃5%CO2饱和湿度条件下培养猪口腔粘膜成纤维细胞(porcine oral mucosa fibroblasts, POMF)。 免疫组化ABC法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白抗体染色,作细胞来源鉴定。第四代细胞用于基因转染。 2.2骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)体外分离与培养 实验猪经麻醉后,用16号穿刺针于股骨大转子处穿刺,抽取骨髓4ml,置于肝素化的25ml无菌培养液中,1000r/min离心10min,弃上清,在含10%FBS的DMEM,37℃5%CO2饱和湿度条件下培养。5天后全量换液,以后每周2次换液。第三代细胞用于基因转染,作为口腔粘膜成纤维细胞(POMF)的对照组。 2.3 DMP1基因转染及筛选 转染前用含10%FBS的DMEM调整细胞浓度至1×105接种于6孔板中,CO2孵箱培养至60%汇合。将细胞分为三组: A组:为牙本质基质蛋白1基因转染猪口腔粘膜成纤维细胞组,对口腔粘膜成纤维细胞进行牙本质基质蛋白1基因转染,本研究将其命名为牙本质基质蛋白1基因转染的猪口腔粘膜成纤维细胞(dentin matrix protein1- porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF)。 B组:为载体基因转染口腔粘膜成纤维细胞组,对口腔粘膜成纤维细胞转染空载体pEGFP-C1基因,本研究将其命名为载体基因转染的口腔粘膜成纤维细胞(pEGFP-C1-porcine oral mucosa fibroblasts,C1-POMF)。 C组:为牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间质干细胞组,对骨髓间质干细胞进行牙本质基质蛋白1基因转染,本研究将其命名为牙本质基质蛋白1基因转染的骨髓间质干细胞(dentin matrix protein1- mesenchymal stem cells,DMP1-MSC)。 细胞转染48h后,按1

本文编号：2743791