丹参酮ⅡA诱导口腔鳞癌细胞自噬的抗癌作用及分子机制研究

发布时间：2020-07-08 03:48

【摘要】：口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔内最常见的原发肿瘤。目前口腔癌的主要治疗手段包括手术和放射治疗,但传统的治疗方式存在不足,并且相当大比例的口腔癌患者可能发生转移和复发。为了提高口腔鳞状细胞癌的治疗效率,大量的研究关注于探索新的药物治疗靶点。自噬过程被认为是其中可能的靶点之一。自噬(autophagy)是一种广泛存在于真核生物细胞内的物质降解途径,对维持细胞内稳态和细胞器更新都有着重大的意义。在肿瘤的发生发展过程中,自噬活动贯穿全程。自噬维持稳态,对抗压力的属性也使它同时具有抑制肿瘤和促进肿瘤的双重属性。天然抗肿瘤的一些小分子化合物在化疗药物中占有重要地位。目前从天然药物中寻找新的抗肿瘤药物已经成为研究热点。丹参,为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎。丹参酮ⅡA是从丹参中提取分离得到的二萜醌类化合物,被认为是丹参的主要有效成分。继往文献报道丹参酮ⅡA具有广谱抗肿瘤活性,还能通过诱导自噬使口腔鳞癌细胞对放射治疗敏化。据此我们推测丹参酮ⅡA可能通过调控自噬对口腔鳞癌细胞同样具有抗肿瘤作用。在本研究中,我们主要关注丹参酮ⅡA是否对口腔鳞癌细胞具有抑制作用,丹参酮ⅡA能否诱导口腔鳞癌细胞自噬,丹参酮ⅡA诱导鳞癌自噬的分子机制是什么以及丹参酮ⅡA对口腔鳞癌细胞的抑制作用和自噬的关系,以此探讨丹参酮ⅡA对口腔鳞癌潜在的治疗价值以及自噬过程在口腔鳞癌的治疗中可能发挥的作用。本课题采用人口腔鳞癌细胞系SCC-9和敲低beclin1表达的SCC-9细胞系用于体外实验,OSCC荷瘤裸鼠模型用于体内实验研究。用不同浓度的丹参酮ⅡA处理SCC-9细胞后,通过CCK8实验检测丹参酮ⅡA对SCC-9细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测SCC-9细胞的凋亡水平,透射电子显微镜检测和免疫荧光实验检测SCC-9细胞的自噬水平,并通过western blotting实验测定BECLIN1,ATG7,ATG12-ATG5,PI3K,AKT,mTOR C1等蛋白的表达水平。在后续实验中,用将细胞分为A空白组:加入新鲜培养液;B TAN组:调节培养液丹参酮ⅡA浓度为18μM;C siBECLIN1组:使用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞进行实验,余同空白组;D TAN+siBECLIN1组:使用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞进行实验,调节培养液丹参酮ⅡA浓度为18μM;E CQ组:培养液中加入自噬抑制剂氯喹。检测各组细胞的凋亡水平,自噬水平及自噬相关蛋白的表达水平。在体内实验中,雄性BALB/c-nu小鼠被随机分为三个实验组,空白组:裸鼠皮下注射SCC-9细胞荷瘤;TAN组:裸鼠皮下注射SCC-9细胞后,注射区域局部注射丹参酮ⅡA;si BECLIN1+TAN:采用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞,配合TAN组的成瘤操作方法进行荷瘤;小鼠四周后麻醉处死,通过定期记录瘤体体积描绘肿瘤生长曲线;通过HE染色观察肿瘤细胞结构;通过免疫组化染色和western blotting检测自噬相关蛋白表达水平。体外细胞实验证实了丹参酮ⅡA对SCC-9细胞增殖的抑制作用,丹参酮ⅡA诱导SCC-9细胞发生caspase-3依赖的凋亡。同时发现丹参酮ⅡA通过对BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5的诱导作用和对PI3K/AKT/mTOR的抑制作用共同促进了SCC-9细胞自噬。丹参酮ⅡA对SCC-9细胞的自噬诱导作用主要依赖于BECLIN1的活性,自噬促进丹参酮ⅡA抑瘤作用。OSCC荷瘤裸鼠模型上的结果进一步验证了体外细胞实验结果。给予丹参酮ⅡA可抑制BALB/c-nu小鼠SCC-9肿瘤的生长速度,敲低BECLIN1的SCC-9肿瘤可以抵抗丹参酮ⅡA的抑瘤作用;给予丹参酮ⅡA可以诱导SCC-9肿瘤发生自噬;同样处理条件下敲低BECLIN1的SCC-9肿瘤自噬水平较SCC-9肿瘤降低。根据结果我们推断丹参酮ⅡA对OSCC细胞的抑制作用基于部分依赖于BECLIN1的作用机制:beclin1基因的敲低阻断了丹参酮ⅡA在体内和体外对SCC-9细胞的作用。本研究初步解释了丹参酮ⅡA的作用机理:通过诱导BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5通路和抑制PI3K/AKT/mTOR通路共同诱导OSCC的细胞自噬,从而抑制了肿瘤的生长。本研究证实了丹参酮ⅡA对OSCC细胞的抗肿瘤作用,提示对自噬的调控有可能成为治疗OSCC的新的靶点。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8
【图文】：

丹参酮IIA,细胞增殖,丹参酮,抑制作用

图 1.3.1 不同浓度丹参酮 IIA 对 SCC-9 细胞增殖的抑制作用同浓度丹参酮 IIA 不同作用时间对人鳞癌细胞系 SCC-9 增殖的抑 SCC-9 细胞中加入丹参酮 IIA 药液培养后，SCC-9 细胞受到明显存在明显剂量依赖，药物处理各组相比对照组均有显著差异，2 倍 0.5 倍 IC50 组有显著差异。同时随着时间推移，丹参酮 IIA 的抑 1.3.2）。

丹参酮,丹参酮IIA,抑制作用,空白

图 1.3.1 不同浓度丹参酮 IIA 对 SCC-9 细胞增殖的抑制作用度丹参酮 IIA 不同作用时间对人鳞癌细胞系 SCC-9 增9 细胞中加入丹参酮 IIA 药液培养后，SCC-9 细胞受显剂量依赖，药物处理各组相比对照组均有显著差异 IC50 组有显著差异。同时随着时间推移，丹参酮 II2）。

相关蛋白,表达水平,丹参酮,显著差

图 1.3.3 流式细胞仪检测检测不同浓度丹参酮 IIA 诱导 SCC-9 细胞凋亡的能力组；B 0.5 倍 IC50 组；C 1 倍 IC50 组；D 2 倍 IC50 组；E 不同浓度丹参酮 IIA 诱细胞的凋亡率，*：与空白组有显著差异，p < 0.05；**：与 0.5 倍 IC50 组有显著差0.05.1.3.4 Western blotting 检测凋亡相关蛋白表达水平随着丹参酮 IIA 浓度的增加，caspase-3 的表达水平升高，提示凋亡水高。

【参考文献】