高糖促进P.g LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子机制的初步研究

发布时间：2020-07-08 16:22

【摘要】：目的： 通过体外培养获得人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),采用高浓度葡萄糖、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)对细胞进行刺激,酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测HGFs分泌肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)的水平,运用实时定量PCR检测Toll样受体2(Toll-like receptor2, TLR2)和Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)在HGFs中的表达,并用anti-TLR2和anti-TLR4单克隆抗体阻断后观察IL-1β和TNF-α水平的变化,以期初步探讨高糖对P.g LPS刺激HGFs分泌炎症细胞因子的作用及其机制,为阐明糖尿病性牙周炎的发病机制提供实验依据。 方法： 1.在天津医科大学口腔医院颌面外科选择第三磨牙阻生齿完全埋伏、身体健康的患者5例(年龄18-25岁),获得患者的知情同意后,在智齿拔除过程中收集牙龈。用无菌中性蛋白分散酶(Dispase Ⅱ)消化分离牙龈上皮后,组织块法培养牙龈成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察其形态及生长状况。 2.采用ELISA检测高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激6h和12h后细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的变化,以低糖组、P.g LPS/低糖刺激组作对照。 3.以高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激HGFs6h和12h后,采用实时定量PCR检测TLR2和TLR4在HGFs中的表达水平,设低糖组、P.g LPS/低糖刺激组作对照。 4.应用anti-TLR2和anti-TLR4的单克隆抗体对HGFs表面的TLR.2、4进行阻断,用高糖或P.g LPS/高糖刺激HGFs12h后,以酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-1β的水平,设高糖或P.g LPS/高糖刺激作对照组。 结果： 1.倒置显微镜下观察细胞培养至第7-10天,少数长梭形细胞从组织块边缘爬出,并围绕组织块呈放射状排列,传代后细胞生长迅速。 2.与低糖对照组相比,高糖刺激6h后TNF-α分泌增加且随着时间延长,TNF-α分泌明显增加,呈时间依赖性(p0.05)。虽然IL-1p水平在6h没有明显增加,但在12h时显著升高(p0.05)。渗透压对照组与低糖对照组相比,TNF-α和IL-1β水平没有明显变化。 3.与低糖对照组相比,高糖刺激6h时TLR2mRNA表达明显升高(p0.05),在12h时升高更加明显(p0.05)。而在不同的时间下高糖对TLR4的表达刺激效应无差异(p0.05)。渗透压对照组与低糖对照组相比TLR2和TLR4mRNA水平差别无统计学意义(p0.05)。 4.采用anti-TLR2单克隆抗体预先处理HGFs后,高糖刺激HGFs产生的TNF-α、IL-1β水平明显下降(p0.05),而anti-TLR4抗体预处理后TNF-α、IL-1β水平变化无显著差异(p0.05)。 5.与低糖组相比较,P.g LPS/低糖刺激HGFs6h和12h后,TLR2的表达和炎症细胞因子TNF-α、IL-1β分泌显著升高,呈浓度依赖性(p0.05),而且随时间的延长TNF-α、IL-1β分泌明显增加(p0.05)。TLR4在P.g LPS/低糖刺激HGFs6h后的表达明显升高(p0.05),但P.g LPS刺激细胞12h后,TLR4的表达与对照组无差别(p0.05)。 6.与LPS/低糖刺激组比较,高糖可明显促进LPS刺激HGFs表面TLR2、4的表达,同时显著促进炎症因子IL-1β、TNF-α的分泌(p0.05)。采用anti-TLR2单克隆抗体、anti-TLR4抗体预先处理HGFs后,P.g LPS/高糖刺激HGFs12h产生的TNF-α、IL-1β水平明显下降(p0.05)。 结论： 1.组织块培养法培养HGFs方法简单,组织定位明确,组织块贴壁是培养成功的关键因素。 2.高糖可通过诱导HGFs表面TLR2mRNA的表达升高,从而促进炎症细胞因子TNF-α和IL-1p的分泌。而TLR4不参与单纯高糖刺激炎症细胞因子的分泌过程。 3. P.g LPS促进HGFs产生炎症细胞因子,早期可能主要通过其表面的TLR2和TLR4来介导炎症细胞因子的分泌,随后主要通过其表面的TLR2来介导炎症反应。 4.高糖可明显促进P.g LPS刺激HGFs表面TLR2和TLR4mRNA的表达及炎症细胞因子的分泌,从而在一定程度上证实糖尿病患者血糖升高可加重牙周炎症。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.42;R587.2

【参考文献】

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1 付永伟;和红兵;欧炯光;;糖尿病性牙周炎与细胞凋亡[J];现代口腔医学杂志;2008年02期

本文编号：2746770