脂多糖对不同鼠龄牙髓干细胞增殖及矿化特性影响的实验研究
发布时间：2020-07-11 11:25
【摘要】：研究背景牙髓干细胞是一群存在于牙髓组织中间充质来源的成体干细胞,具有高增殖活性、自我更新能力及多向分化潜能。在牙髓损伤修复过程中,可以分化为成牙本质细胞、成纤维细胞等功能细胞,维持局部组织的稳态平衡,在牙髓组织的损伤修复中发挥重要作用。然而,随着年龄的增长,组织干细胞的再生潜能下降。这可能与干细胞数目的减少、固有功能减弱及干细胞所处的微环境改变相关。当牙髓组织暴露于细菌的代谢产物时,可产生不同程度的炎症反应。炎症反应轻微时,牙髓干细胞可分化为成牙本质细胞,参与牙髓组织修复过程,炎症剧烈时可引起牙髓组织坏死。供体年龄作为影响细胞生存微环境的重要因素之一,对牙髓干细胞的增殖和分化具有一定的影响。然而,关于不同年龄供体来源的牙髓干细胞对炎症刺激的反应及修复的能力的差异目前相关报道甚少。故本实验拟采用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激牙髓干细胞体外模拟炎症微环境,探究不同鼠龄牙髓干细胞在炎症状态下增殖及矿化等相关特性的差异,进一步探究年龄因素对牙髓干细胞受炎症刺激后修复再生能力的影响,为牙髓干细胞在牙髓损伤修复中的应用提供理论基础。材料与方法1.幼龄大鼠牙髓干细胞及成龄大鼠牙髓干细胞分离培养及鉴定采用改良组织块酶消化法从幼龄Sprague-Dawley大鼠及成龄Sprague-Dawley大鼠牙髓组织中分离纯化出牙髓干细胞,命名为幼龄鼠牙髓干细胞(juvenile rat dental pulp stem cells,JDPSCs)与成龄鼠牙髓干细胞(adult rat dental pulp stem cells,ADPSCs)。进行成脂、成骨/成牙本质向诱导分化,检测多向分化潜能;流式细胞术检测相关细胞表面标记物的表达。2.大鼠牙髓组织及牙髓干细胞增龄性变化两种鼠龄牙髓组织切片HE染色、牙髓干细胞及组织切片衰老相关(β-半乳糖苷酶(Senescence p-Galactosidase,SA-P-Gal)染色比较大鼠牙髓组织、牙髓干细胞增龄性变化;CCK8实验、流式细胞术比较JDPSCs和ADPSCs增殖能力。3.不同浓度LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖及矿化的影响采用CCK8实验及流式细胞术检测LPS对JDPSCs和ADPSCs增殖能力的影响。在矿化诱导的条件下,采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR及Western Blot等检测LPS对JDPSCs和ADPSCs成骨/成牙本质向分化的影响。结果1.JDPSCs和ADPSCs的生物学特性及牙髓组织的增龄性变化本实验成功从大鼠牙髓组织中分离纯化出JDPSCs和ADPSCs,两种细胞均可成骨/成牙本质向及成脂向分化,阳性表达间充质干细胞表面标分子记物CD90、CD29,阴性表达造血干细胞表面分子标记物CD45;从刺激的第1d起,在同一时间点下ADPSCs的增殖OD低于JDPSCs(P0.01),ADPSCs处于S期的细胞比例显著低于JDPSCs(P0.01);ADPSCs较JDPSCs有更高的SA-β-Gal表达水平(P0.01);成龄鼠牙髓组织血管含量及组织SA-β-Gal表达较幼龄鼠的增多。2.JDPSCs和ADPSCs在LPS刺激下细胞增殖及矿化的变化CCK8结果显示LPS刺激浓度为0.1-1μg/mL时,从刺激的第1d至第5d,在同一时间点,JDPSCs受LPS刺激实验组较无LPS刺激对照组OD值显著升高,ADPSCs受LPS刺激实验组较对照组的OD值高(P0.01),且在LPS刺激下JDPSCs组的增加趋势明显大于ADPSCs组;当LPS浓度为10 μg/mL或100 μg/mL时,JDPSCs及ADPSCs在刺激的早期(24 h),同一时间点下,实验组较无LPS刺激的对照组OD值明显升高(P0.05),而随着刺激时间延长,实验组的OD值降低。在矿化诱导条件下,低浓度的LPS(1 μg/mL)均能促进JDPSCs和ADPSCs矿化结节形成,JDPSCs增多趋势较ADPSCs明显;RT-PCR及Western Blot结果表明低浓度LPS促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因(ALP、OCN、BSP、DSPP)及蛋白(ALP)的表达,且JDPSCs促进趋势明显高于ADPSCs。结论1.幼龄及成龄大鼠牙髓组织中可分离培养出牙髓干细胞,JDPSCs和ADPSCs均为间充质来源,具有多向分化潜能。JDPSCs比ADPSCs有较高增殖能力,较低的SA-p-Gal表达水平。2.低浓度LPS(0.1-1 μg/mL)促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,并且对JDPSCs促进程度明显大于ADPSCs。较高浓度(10μg/mL或100μg/mL)LPS短时间(24 h)刺激可促进JDPSCs及ADPSCs的增殖,随着刺激时间的延长抑制增殖。3.低浓度的LPS(0.5 μg/mL)可以促进JDPSCs和ADPSCs矿化相关基因及蛋白的表达,及矿化结节的形成,LPS对JDPSCs成骨/成牙向分化的促进作用较ADPSCs明显,提示JDPSCs较ADPSCs在一定程度的炎症微环境中有更强的修复能力。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：
逦颂士学位论文逦逡逑如图１－１邋Ｄ，两种细胞均为短梭形、多角形，呈放射状或漩涡状围绕在组织块四逡逑周，两种细胞形态无明显差异。将第Ｉ代细胞进行有限稀释法纯化培养，培养逡逑的第１４邋ｄ两种细胞均能形成集落样生长如图１－１邋Ｂ、Ｅ。将幼龄及成龄大鼠牙髓逡逑干细胞以相同密度传代，均贴壁良好，幼龄大鼠牙髓干细胞增殖速度较快，约逡逑６－７邋ｄ细胞密度达９５％如图１－１邋Ｃ，成龄大鼠牙髓干细胞８－１０邋ｄ细胞密度达９５％逡逑如图１－１邋Ｆ。逡逑
逦第一章幼龄及成龄大鼠牙髓干细胞分离培养及鉴定逦逡逑中有大小不一的深红色矿化结节形成如图１－２Ａ、Ｃ。逡逑２．２．２邋ＪＤＰＳＣｓ与ＡＤＰＳＣｓ的成脂向诱导分化逡逑幼龄及成龄大鼠牙髓干细胞成脂向分化诱导７邋ｄ后，倒置显微镜下观察，细逡逑胞密集生长，细胞成多角形，在细胞内可见透明小脂滴形成。将两种细胞固定逡逑后，行油红０染色，镜下均可见细胞内有橘红色脂滴形成（图１－２邋Ｂ、Ｄ）。逡逑
３讨论逡逑本研[偛捎酶牧甲橹槊赶ǔ晒Υ佑琢洌ǎ粗芰洌┘俺闪洌ǎ对铝洌┐棋义闲裕樱拇笫笱浪枳橹蟹掷肱嘌鲅浪柘赴徊酵ü邢尴∈头ǚ掷氪炕鲥义涎浪韪上赴Ｄ壳肮赜谘浪韪上赴姆掷肱嘌际跫航衔墒欤Ｓ玫姆掷肱噱义涎椒ㄖ饕ㄗ橹榉ā⒚赶ㄒ约案牧甲橹槊赶ǎ常罚薄９谘д卟慑义嫌妹赶ù哟笫笱浪枳橹掷肱嘌笫笱浪韪上赴⒅っ髌渚哂薪锨康脑鲥义现臣俺裳辣局剩晒窍蚍只芰Γ常福薄ｅ义媳狙芯吭谇捌谑笛樘剿髦胁捎米橹榉ㄅ嘌浪韪上赴鄄斓接琢浯笫箦义涎浪枳橹樵谔诤蟮模罚保板澹銺嚿伲拖赴ǔ觯持茏笥以赴拍芙惺状五义洗闪浯笫笙赴幼橹榕莱鍪奔涓恚晒β矢汀８梅椒ㄋ淙徊僮麇义喜街柘喽约虻ィ嘌赴晒β实汀⒅芷诔ぃ岩晕笮笛樘峁┫赴С帧ｅ义险饪赡苁怯捎谖淳赶淖橹渲氏宋煞侄嗲抑旅茏璋赴ǔ觯⑶业卞义
本文编号：2750344
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：
逦颂士学位论文逦逡逑如图１－１邋Ｄ，两种细胞均为短梭形、多角形，呈放射状或漩涡状围绕在组织块四逡逑周，两种细胞形态无明显差异。将第Ｉ代细胞进行有限稀释法纯化培养，培养逡逑的第１４邋ｄ两种细胞均能形成集落样生长如图１－１邋Ｂ、Ｅ。将幼龄及成龄大鼠牙髓逡逑干细胞以相同密度传代，均贴壁良好，幼龄大鼠牙髓干细胞增殖速度较快，约逡逑６－７邋ｄ细胞密度达９５％如图１－１邋Ｃ，成龄大鼠牙髓干细胞８－１０邋ｄ细胞密度达９５％逡逑如图１－１邋Ｆ。逡逑
逦第一章幼龄及成龄大鼠牙髓干细胞分离培养及鉴定逦逡逑中有大小不一的深红色矿化结节形成如图１－２Ａ、Ｃ。逡逑２．２．２邋ＪＤＰＳＣｓ与ＡＤＰＳＣｓ的成脂向诱导分化逡逑幼龄及成龄大鼠牙髓干细胞成脂向分化诱导７邋ｄ后，倒置显微镜下观察，细逡逑胞密集生长，细胞成多角形，在细胞内可见透明小脂滴形成。将两种细胞固定逡逑后，行油红０染色，镜下均可见细胞内有橘红色脂滴形成（图１－２邋Ｂ、Ｄ）。逡逑
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本文编号：2750344
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