转录共调节因子FHL2对人牙髓细胞分化及矿化的调控作用研究

发布时间：2020-07-20 10:07

【摘要】：目的：牙齿硬组织发育过程包括基质的形成和矿化的发生,是在成牙本质细胞分化形成后,接着开始形成牙本质的有机基质,由成牙本质细胞形成的Ⅰ型胶原分泌到基质中去,与基质共同形成最早的牙本质基质。除了Ⅰ型胶原外,成牙本质细胞还分泌非胶原蛋白,包括：牙本质磷蛋白(detin phosphoproteins, DPP)、牙本质涎蛋白(detin sialoprotein, DSP)、牙本质涎磷蛋白(detin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和其他一些生长因子及金属蛋白酶等。其中DPP、DSP和DSPP属于牙本质特异性蛋白,而DMP1、BSP、OPN、OCN为矿化组织特异性蛋白,它们在诱导细胞分化及促进牙本质矿化起重要的作用。在牙本质基质形成和矿化的过程中,有很多的生长因子,细胞因子和转录因子等参与进来,但它们确切的调控机制尚不清楚。 FHL2(Four and a half LIM domains2)蛋白分子结构中含有4个半LIM结构域,共含有279个氨基酸。其中,LIM结构域是以结构中的前三个蛋白Lin-11、Isl-1和Mec-3的首字母命名的,LIM结构域是含有55个氨基酸残基的序列,富含半胱氨基酸并含锌指结构的结构域。LIM结构域作为蛋白与蛋白之间相互作用的结构域,在细胞分化、信号转导和细胞骨架的形成中发挥着不可替代的作用。而FHL2蛋白作为完全由LIM结构域组成的蛋白同样发挥着LIM结构域的功能,并且由于FHL2结构的差异性又有着与LIM结构域不同的作用。研究表明,FHL2通过LIM结构域与某些受体、激酶、转录因子、信号分子等蛋白相互作用,在基因表达,蛋白分泌,细胞分化,形态发生、组织形成等过程中发挥着重要的调控作用。近年来研究发现FHL2蛋白作为重要的转录共激活子,在成骨细胞的分化、矿化和骨组织的形成中发挥重要的调节作用。进一步的研究表明FHL2通过转录共调节整合素蛋白家族、Wnt、 RUNX2等信号通路参与骨组织的形成。牙髓细胞向成牙本质细胞分化及矿化过程中有类似骨组织的硬组织形成,我们推测FHL2可能也参与牙齿硬组织的形成过程。我们课题组前期实验结果表明FHL2在牙齿发育过程中呈时空特异性表达,FHL2可能对牙胚发育、细胞分化(包括成釉细胞及成牙本质细胞)、形态发生及硬组织基质的分泌与矿化有重要的调节作用。本实验在前期研究基础上,为进一步检测FHL2对牙本质形成的调控作用,我们体外培养了人牙髓细胞,并制备FHL2真核表达载体质粒,将所制备的质粒转染入人牙髓细胞,使之稳定过表达FHL2蛋白,观察FHL2对人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化及矿化的影响,从而进一步阐明FHL2对牙本质形成的调控作用机制。材料和方法： 1.组织块培养法和胶原酶消化法培养分离人牙髓细胞,比较两方法的差异性,加入矿化诱导液使牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化并矿化,检测在这一过程中FHL2mRNA和蛋白表达量的变化。 2.大肠杆菌提取重组质粒pcDNA3-FHL2-Flag和空载体质粒pcDNA3,双酶切实验和质粒测序检验重组质粒中插入的FHL2基因读码框架。 3.将FHL2重组质粒pcDNA3-FHL2-Flag和空载体质粒pcDNA3瞬时转染入人牙髓细胞,72h后检测带有外源基因的重组质粒能否在人牙髓细胞中表达。 4.将pcDNA3-FHL2-Flag稳定转染入人牙髓细胞,检测牙髓细胞向人成牙本质细胞样细胞分化和矿化过程中,ALP、BSP、OPN及DSPP等蛋白的表达差异及矿化结节的形成情况。结果： 1.利用组织块法和酶消化组织块法均可分离培养出牙髓细胞,成功获得了人牙髓细胞体外培养的研究模型。 2.加入矿化诱导液后,诱导牙髓细胞矿化,Real time PCR和Western blot检测发现随着矿化诱导时间的延长,FHL2蛋白表达量逐渐增加,诱导7d到14d时FHL2表达量增加最显著。 3.重组质粒pcDNA3-FHL2-Flag经酶切鉴定和重组质粒测序,结果显示加入了编码正确的FHL2基因,成功制备了基因全长FHL2的真核表达载体,转染人牙髓细胞后经G418筛选获得稳定表达株。RT-PCR结果显示稳定转染细胞中具有大量目的基因mRNA转录,Western blot检测培养细胞中蛋白表达呈阳性,同时稳定表达FHL2的细胞可以检测到标签蛋白Flag。 4.检测各组牙髓细胞在向成牙本质细胞样细胞分化及矿化过程中,稳定过表达FHL2的牙髓细胞中ALP的活性显著增高；矿化结节形成的数量较转染空载体组和未转染组明显增加；成骨相关因子mRNA和蛋白表达量均有所上调。结论： 1.利用组织块法和酶消化组织块法均可分离培养出牙髓细胞,酶消化组织块法可较早见到细胞爬出,并且细胞生长较快且状态较好,组织块法培养牙髓细胞时间较长,且失败率较酶消化法高。 2.在人牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞的分化及矿化过程中(Od,7d,14d,21d),FHL2的表达量逐渐增加,提示FHL2可能参与了牙本质的形成过程。 3.重组质粒pcDNA3-FHL2-Flag经鉴定加入了正确的FHL2编码框,瞬时转染牙髓细胞后,牙髓细胞可表达FHL2蛋白和标签蛋白Flag,经G418筛选获得了可以稳定表达FHL2的人牙髓细胞。说明重组质粒pcDNA3-FHL2-Flag可以作为外源性的FHL2基因转染入人牙髓细胞,从而进一步研究FHL2在牙本质形成中的作用机制。 4.稳定过表达FHL2的牙髓细胞中ALP的活性显著增高；矿化结节形成的数量较转染空载体组和未转染组明显增加；牙髓细胞内的成骨相关因子mRNA和蛋白表达量均有所上调,提示FHL2在牙髓细胞的分化和矿化过程中发挥重要的正调控作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781

【参考文献】