牙周膜细胞膜片的构建及脂肪干细胞向内皮细胞分化的初步研究

发布时间：2020-07-22 22:15

【摘要】：牙周炎是一种慢性感染性疾病,可破坏结缔组织基质和细胞,导致牙槽骨吸收,最终导致牙齿缺失。目前对牙周炎的治疗均无法恢复原始的牙周组织结构。组织工程作为重建缺失组织,产生新生组织的技术,为实现牙周组织再生提供了新的思路和方法。人牙周膜细胞(hPDLCs)具有多向分化潜能,可作为牙周组织工程的种子细胞之一。L-抗坏血酸-2-磷酸酯(L-AS-2-P)是抗坏血酸的衍生物,通过诱导I型胶原的合成,增加细胞外基质的聚积促进细胞膜片的形成。细胞膜片克服了传统支架空间体积大,降解的物质对细胞毒性损伤的缺陷,仅依靠增加内源性细胞外基质而形成,在保证种子细胞活性的同时,还可增大细胞密度。但是单层细胞膜片内细胞外基质的含量有限,易收缩,并且在转移时需要借助承载系统,而承托材料在降解时所释放的物质又成为组织再生的不利因素。因此构建操作性能强的膜片是亟待解决的问题。组织工程产品长期存活,依赖于及时地建立血供。丰富血供不仅可为细胞提供营养,还可维持组织稳态。而在组织工程产品血管化发生过程中,内皮细胞具有重要的作用。但是成体内皮细胞取材不方便,且具有免疫抑制性。脂肪干细胞(ADSCs)可经诱导分化为内皮细胞,而且来源丰富且无免疫源性,可为组织工程血管化提供内皮细胞来源。目的： 1.构建hPDLCs膜片三维聚合体和三层复合膜片 2.尝试应用内皮培养基(EGM-2)体外诱导ADSCs向内皮细胞分化,并构建PDLCs-ECs-PDLCs的三明治结构复合膜片方法： 1.单层膜片的制备组织块贴壁法原代培养牙周膜成纤维细胞,检测骨桥蛋白,鉴定其成骨特性。按照不同浓度L-AS-2-P,不同初始接种密度将hPDLCs分组,根据形成膜片所需时间最短,膜片可操作性最强的原则,筛选出最适条件。 2.三维聚合体的制备将刮下的单层hPDLCs膜片在最适培养条件下自然皱缩7d,获得三维聚合体。观察其操作性能的改变。并通过HE染色,观察聚合体细胞密度、细胞外基质的情况。 3.三层复合膜片的制备在共聚焦培养皿中制备第一层hPDLCs膜片,在6孔板内制备第二层和第三层细胞膜片,然后将6孔板内的hPDLCs膜片依次转移到共聚焦培养皿中的第一层膜片上。为观察细胞膜片覆合后的状况,在膜片转移之前,应用Hoechst33258荧光染料进行细胞核的染色,分为两种模式,一为对第一层和第三层细胞膜片进行荧光染色,二为只对第二层膜片进行染色。膜片覆合完成后即进行共聚焦显微镜观察并采集照片。 4.EGM-2诱导ADSCs向内皮细胞分化皮下脂肪组织经胶原酶消化后获得脂肪间充质细胞,通过诱导其向成骨、成脂细胞分化,鉴定其干细胞特性。继而应用EGM-2诱导其向内皮细胞分化,分别在7d、14d进行CD31免疫组化染色。结果： 1.牙周膜细胞膜片三维聚合体呈球状,质韧,可随意切割。HE染色显示细胞密度较高,细胞之间有大量细胞外基质。 2.三层复合膜片在共聚焦显微镜下观察显示,荧光细胞密度和亮度的渐变规律与膜片应用荧光染色的模式一致。 3.脂肪间充质细胞可向成骨、成脂分化,具有干细胞特性。但经EGM-2诱导其向内皮细胞分化至14d时,仍未检测到CD31的表达。结论： 1.我们成功构建了操作性能较强的PDLCs膜片三维聚合体和三层复合膜片。 2.在脂肪干细胞向内皮分化过程中,我们未检测到CD31的表达,有待进一步研究。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R781.4

【参考文献】