牙根发育期相关间充质干细胞生物学特性的研究

发布时间：2020-07-30 01:15

【摘要】： 如何构建具有生物活性的组织工程化牙根是当前牙齿再生研究中的一个“瓶颈”问题,直接关系到牙齿组织工程的成败和最终走向。种子细胞作为牙齿组织工程中的一个关键因素之一,一直是国内外学者着力研究的热点课题。传统牙根/牙周组织工程中应用的种子细胞主要来源于成体干细胞,鉴于其不存在伦理问题,并具有可在体外操作、来源丰富、可塑性强、无免疫排斥等特点,已成为牙根/牙周组织工程中极具应用优势的种子细胞。但作为成体干细胞,同时也面临着一系列问题,诸如:稳定、可靠的细胞来源;干细胞数量少,大规模体外扩增传代培养如何维持干细胞状态;如何实现定向诱导分化形成稳定的结构等,这些缺点最终限制了牙根/牙周组织工程的发展。然而,随着发育组织工程学的出现,为组织工程生物活性牙根/牙周组织的构建提供了崭新的思路和方法。从牙根发育早期获得的牙根根端复合体是牙根发育的“器官始基”,由根端牙乳头、上皮根鞘和根端牙囊三部分结构组成,通过上皮-间充质间的相互调控作用,具有独立生成牙根牙周组织的能力。我们认为发育期牙根根端复合体来源的间充质干细胞为异质性,理论上具有形成牙根各部分,即牙髓/牙本质复合体和牙骨质/牙周膜/牙槽骨复合体的能力,可能作为候选种子细胞应用于牙根/牙周组织工程。因此,本研究拟对牙根发育期相关间充质干细胞的生物学特性进行研究,探讨其作为种子细胞在牙根/牙周组织工程中应用的可行性,以期为组织工程化牙根/牙周组织构建优选新的种子细胞。所取得的主要研究结果如下: 1.人-牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞克隆表型筛选为了验证牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞作为组织工程化牙根/牙周复合体种子细胞的可行性,本实验分离培养了人牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞并进行相关生物学特性检测;采用有限稀释法筛选单克隆细胞,通过体内体外分化实验进行克隆表型鉴定,观察不同克隆表型干细胞的牙根/牙周组织再生能力。结果显示:牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞为异质性;具有显著的“胚胎性”组织特征:表现出极高的增殖活性、克隆形成能力和体外多向分化能力;在体内可以异位形成类牙骨质和类牙本质样矿化结构。同时从牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞中成功筛选出成骨和成纤维两种单克隆细胞表型,其中成骨表型单克隆细胞的体外矿化能力显著强于成纤维表型单克隆细胞,并在体内异位形成均质样矿化结构,而成纤维表型单克隆细胞则形成纤维结缔组织样结构。本研究结果说明,牙根发育期根尖复合体来源间充质干细胞可以作为牙根/牙周组织工程中的种子细胞,不同表型的克隆细胞具有形成特定牙体结构的潜力,将不同表型克隆重组以构建完整生物活性牙根/牙周组织结构在理论上具有可行性。 2.人-牙根发育期根端牙囊干细胞生物学特性研究为了评估牙根发育期根端牙囊干细胞作为组织工程化牙周复合体种子细胞的可行性,本实验以人成体牙周膜干细胞为对照,分离培养了人牙根发育期根端牙囊干细胞,进行体外生物学特性检测,并观察其形成牙周组织的能力;通过体外培养,观察长期传代对其干细胞生物学性状的影响。结果显示:从牙根发育期获得的根端牙囊干细胞与成体组织来源的牙周膜干细胞相比,在组织学、细胞学及分子生物学等方面存在一系列的差异:在体外具有更强的干细胞特性(增殖活性、克隆形成能力、多向分化能力);在体内可以异位形成类牙骨质/牙周膜样复合体结构。经过长期传代,根端牙囊干细胞的细胞形态学发生变化,并逐渐丧失其干细胞生物学特性,同时伴有ALP、成骨相关基因表达降低以及体内组织再生能力丧失。本研究结果说明,从牙根发育期获得的根端牙囊干细胞完全区别于成体组织来源的牙周膜干细胞,是一种新型的发育期组织来源间充质干细胞。可以作为一种新的候选种子细胞应用于牙周再生组织工程。在牙组织工程研究中,种子细胞应避免长期传代导致干细胞生物学性状发生变化。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78
【图文】：

细胞周期,G0期,静止状态,DNA合成

图1.3 DAC-MSCs细胞周期期外，处于静止状态时期；G1 期：DNA 合成前合成期；G2 期：DNA 合成后期；M 期：有丝分细胞生物学特性鉴定测的结果表明，16.1%的DAC-MSCs Stro-1 表D146 表达阳性(图1.4 A,B)。Stro-1 和CD14面标记物，说明获得的DAC-MSCs 为间充质一样，人DAC-MSCs具有很强的克隆形成能SCs 呈集落样生长，细胞形态多为长梭形类色显示，DAC-MSCs 的克隆形成率约78向分化潜能，我们分别对多克隆来源的DAC结果显示茜素红和油红O 染色均为阳性(图1

间充质干细胞,标志物,阳性率,成牙骨质细胞

图1.4 DAC-MSCs间充质干细胞表面分子标志物表达A： Stro-1 阳性率为16.1%；B：CD146 阳性率为89.4%2.4 DAC间充质干细胞基因表达PCR 检测结果显示， DAC-MSCs 表达 COL1 、 OCN 、 BSP 、 ALPmRNA(图1.7)。一般来说，BSP、OCN mRNA 多表达于成牙骨质/成骨细胞[126, 127]。综合mRNA 表达的情况，我们认为DAC-MSCs 部分呈现出成牙本质细胞和成牙骨质细胞的基因表型。

细胞生长曲线,迁移能力,增殖速率,细胞迁移

第四军医大学博士学位论文次数的增加，细胞形态发生变化，表现为体积变长的梭形成纤维样。PDLSCs随着传代次数的增加也表现出类似的形态学改变，细胞体变细（图3.2 A-D）。细胞迁移及增殖能力分析为评估细胞的迁移能力，我们对第三代的PAFSCs和PDLSCs进行实验。24小时后，在进行了划痕处理的地方，PAFSCs的迁移距离明LSCs远(P< 0.05)，表现出更强的迁移能力（图3.3 A-C）。为评估细胞的增殖能力，进行了细胞生长曲线的绘制及BrdU阳性。如图3.4，图3.5所示，第三代的PAFSCs较同代数的PDLSC表现出增殖活性(P< 0.05)，但在第二十代，PAFSCs和PDLSCs的增殖速率均降(P< 0.05)，甚至于细胞接近停止分裂。

【参考文献】