靶向PPARγ基因RNA干扰对涎腺腺样囊性癌细胞转移影响的研究

发布时间：2020-08-03 12:10

【摘要】：目的：侵袭性和转移性是恶性肿瘤的本质特征，恶性肿瘤的转移是由包括侵袭肿瘤周围组织，沿顺血液及淋巴系统的运行、在靶器官上大量增殖等步骤组成，而且恶性肿瘤的转移的原因及机制是十分复杂的，与其基因水平上的改变是密切相关的。恶性肿瘤若失去其转移能力，其恶性程度将会大大的降低，但目前在医学科研领域尚没有一个明确的结论能全面的解释恶性肿瘤侵袭及转移现象，故针对于恶性肿瘤侵袭及转移的治疗目前尚无特效的方法，而针对恶性肿瘤转移相关基因的研究已经成为医学科学工作者尝试攻克肿瘤的途径之一。涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是涎腺最常见的，且最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位，该肿瘤生长缓慢，对周围组织浸润性强，治疗后局部易复发，其主要的生物学性状之一是易随血运发生远处转移，而转移的部位以肺为多见，是导致患者死亡的主要原因之一。目前针对涎腺腺样囊性癌（SACC）的治疗主要以手术为主，但是因为其对周围组织侵袭性很强，呈浸润性生长，故很难通过手术一次性切除干净，而且其对化疗及放疗不敏感，预后不佳，对于该肿瘤术后复发及转移的病例的治疗相当棘手，寻找一种针对涎腺腺样囊性癌治疗的有效方法一直是口腔科医学工作者关注的焦点，并且是一道难题。随着针对各种疾病的病因、发展、治疗等过程的基因及分子水平研究的开展及发展，关于涎腺腺样囊性癌基因治疗的相关性研究也逐渐地深入。涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC-LM及肺低转移细胞株SACC-83为同一亲本，两种细胞之间的差异集中在转移的表型上，其中SACC-LM细胞的转移能力明显高于SACC-83细胞。近几年来RNA干扰（RNAinterference, RNAi）研究在不同领域的专家学者的共同努力下已经取得了突破性的飞速进展，于2001被《Science》杂志评为年度十大科学进展之一，并且位列2002年十大科学进展的第一位。RNAi现象发现于1995年，从1998年开始逐渐引起人们的关注及重视。使用RNAi技术可以针对性地抑制沉默特定目的基因进而特异性剔除或者关闭目的基因地表达，随着对RNAi技术的深入研究及飞速发展，目前在探索基因功能、传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域均已有RNAi技术的应用。RNAi将体外人工合成的与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence, PTGS)。过氧化物增殖体激活物受体(peroxisome proliferators activatedreceptors，PPAR)是最新发现的一组核激素受体超家族成员之一，其与甲状腺激素受体、类维生素A受体、类固醇激素受体、及维生素D受体一样，均属于核激素受体，亦被称为脂肪酸受体。研究发现：人类的PPAR有三种亚型，即：PPARα、PPARδ (亦称PPARβ)及PPARγ。其中，PPARγ是目前研究最广泛的一种。最初，科学家们没有发现PPAR的天然配体，然而随着分子生物学相关技术及鉴定方法的不断完善，现在已有数百种PPARγ配体被鉴定出来，并被分为合成配体和天然配体两种。PPARγ参与糖尿病、动脉粥样硬化、炎症、肥胖等的病理生理过程并发挥重要作用，PPARγ主要表达于脂肪组织，除脂肪组织外，在人体中的巨噬细胞及其他脂肪储存细胞，如：肝、肾、肺等中均有表达，肌肉组织基本不表达，PPARγ的主要表现形式是PPARγ1，表达范围广泛。近期相关研究发现，在人类口腔颌面部、呼吸系统、消化系统、生殖系统等的恶性肿瘤中均发现PPARγ的表达，并且其表达量的高低与肿瘤的恶性程度及转移与否存在着关系。相关研究表明，通过多种手段作用于恶性肿瘤细胞中的PPARγ及其配体，能够影响恶性肿瘤的生长及转移，并已应用于肺癌、乳腺癌等一些恶性肿瘤的治疗中。PPARγ基因定位于染色体3p25，含有9个外显子，其基因组结构覆盖100kb。在口腔颌面部恶性肿瘤中，涎腺腺样囊性癌（SACC）极易经血运发生远处转移，且转移以肺部多见。作为恶性肿瘤的重要特征之一，肿瘤若失去转移特性，那么恶性度将大大降低,对肿瘤转移相关的研究是攻克肿瘤治疗难题不可缺少的重要基础工作。PPARγ作为目前研究最广泛、最成熟的核激素受体，有研究表明，其在SACC肺高、低转移细胞株中的表达存在差异，肺高转移细胞株的表达量明显高于肺低转移细胞株，但目前有关PPARγ与SACC远处肺转移相关性的报道很少。本实验采用RNA干扰（RNAi）技术特异性的沉默PPARγ基因的表达，并通过细胞体外迁徙能力实验及建立裸鼠体内涎腺腺样囊性癌肺转移模型，进而探讨PPARγ基因沉默后对SACC肺转移的影响，进一步丰富对SACC转移的研究。方法： 1PT-PCR检测两种细胞株PPARγ基因表达差异分别提取两种细胞的总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，应用PT-PCR技术检测PPARγ基因表达量的不同，β-action基因作为对照，应用SPSS13.0软件单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计学数据处理。 2PPARγ基因siRNA表达载体的构建依据小分子干扰RNA（small interfering，siRNA）的设计原则，由武汉晶赛公司设计并构建PPARγ基因siRNA表达载体，同时选取与PPARγ基因同源性较差的序列作为阴性对照，构建阴性对照载体，最后将U6启动子序列按照Genbank序列（ACCession number X06980）体外化学合成后克隆到PPARγ基因siRNA表达载体，替代原有的启动子，最终获得所需的siRNA表达载体。 3转染按Invitrogen的产品说明将阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳性质粒表达载体、阴性质粒表达载体、空白质粒分别转染涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC-LM和肺低转移细胞株SACC-83，转染后细胞分别命名为：SACC-LM阳性转染组，SACC-LM阴性转染对照组，SACC-LM空白转染对照组；SACC-83阳性转染组，SACC-83阴性转染对照组，SACC-83空白转染对照组。 4镜下观察质粒转染情况转染48h后荧光倒置显微镜下分别在培养各组细胞的各组孔内随机取六个视野观察细胞转染效率，应用SPSS13.0软件单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计学数据处理。 5RT-PCR检测PPARγ基因干扰效率分别提取转染细胞和未转染细胞的总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，应用RT-PCR技术检测PPARγ基因表达量的改变，β-action基因作为对照。 6Transwell小室检测肿瘤细胞体外迁徙能力改变用Matrigel基质膜模拟细胞外基质及Transwell小室检测PPARγ基因干扰沉默后SACC-LM及SACC-83细胞粘附迁徙能力的改变，同时以转染阴性质粒及空白质粒的细胞做对照，应用SPSS13.0软件单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计学数据处理。 7裸鼠体内检测肿瘤细胞转移能力的改变。 4W龄雌性BALB/C nu/nu裸鼠104只，随机分成8组，4号注射器于距尾静脉尖2-3cm处尾静脉注入细胞悬液0.1ml/只，1W后重复注射一次。8W后将裸鼠处死，严格无菌条件下解剖，取出肺脏。在显微镜下用手术剪剥离所有肉眼可见转移灶，将分离的转移灶用电子天平称重并记录，应用SPSS13.0软件单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计学数据处理。结果： 1以β-action为内参，实验所得的条带中，SACC-LM组条带明显较SACC-83组明亮，所得数据经统计学分析，P=0.00＜0.01，存在显著差异，说明SACC-LM细胞PPARγ基因表达量明显高于SACC-83细胞。 2转染48h后镜下观察各组细胞的质粒转染细胞中均可见明亮的绿色荧光，并计算得出SACC-LM阳性转染组、SACC-LM阴性转染对照组、SACC-LM空白转染对照组， SACC-83阳性转染组、SACC-83阴性转染对照组、SACC-83空白转染对照组各组细胞转染效率分别为87.80%、88.02%、86.51%，88.20%、85.31%、87.76%，各组质粒转染效率比较，P=0.609＞0.01，无明显差异。 3RNA干扰后所得条带中，SACC-LM及SACC-83干扰组条带较其他三组对照组相比明显变暗，说明RNA干扰后SACC-LM及SACC-83细胞中PPARγ基因表达量均显著降低。 4RNA干扰后SACC-LM及SACC-83细胞穿过Matrigel人工基底膜的细胞数量均显著减少，P=0.00＜0.05，而SACC-LM阳性转染组细胞穿膜数均值与SACC-83组、SACC-83阴性转染对照组及SACC-83空白转染对照组相近，P=0.444＞0.05。 58组裸鼠体内除肺脏以外，其他部位均未发现结节及淋巴结肿大。SACC-LM组经PPARγ基因沉默干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部转移灶在肉眼下明显减少变小，且SACC-83组经PPARγ基因干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部在肉眼下观察无明显可见转移灶。SACC-LM阳性转染组、SACC-83阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与各自对照组细胞株相比显著减轻，P=0.00＜0.05，有显著差异，而SACC-LM阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与SACC-83组、SACC-83阴性转染对照组及SACC-83空白转染对照组相比，P=0.301＞0.05，无显著差异。结论：特异性地抑制PPARγ基因,沉默其表达后,SACC细胞株体外迁徙能力及肺部转移能力明显降低，证实，特异性地抑制SACC细胞株PPARγ基因的表达能够减低其转移能力，PPARγ基因在SACC转移过程中发挥重要作用，PPARγ有可能成为治疗SACC的新的靶点。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.87

【参考文献】