颌骨骨纤维异常增殖症骨髓基质干细胞的分离培养及Gsα基因突变分析

发布时间：2020-08-05 14:56

【摘要】：目的： 骨纤维异常增殖症(fibrous dysplasia of bone, FD),是一种良性骨纤维组织病损。Robey等认为骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)激活型Gsa基因发生错义突变是导致FD的原因,FD的治疗方法很大程度上依赖于对BMSC生物功能及其如何控制骨再生的研究,因此,从骨纤维异常增殖症病变标本中提取骨髓基质干细胞并测定其Gsα基因的编码基因位点进行突变分析具有重要理论意义和实际价值。 本实验以上述研究结果为基础探讨一种从FD病变标本中分离、培养BMSC的有效方法,为研究FD的病因和发病机制奠定基础,并对骨纤维发育异常的病因学作初步研究,探讨一种关于颌骨骨纤维异常增殖症(FD)患者骨髓基质干细胞(BMSC)的Gsa蛋白编码基因位点突变分析的方法验证颌骨骨纤维异常增殖症的基因突变类型。 方法： 1.骨纤维异常增殖症病变标本中骨髓基质干细胞的分离培养 颌骨FD患者经X线及组织病理学确诊,术中取组织标本将其剪碎后冲洗获得骨髓基质干细胞进行原代培养,观察细胞的形态, 2.骨纤维异常增殖症病变标本中骨髓基质干细胞的生物学特性分析 检测获取的骨髓基质干细胞细胞表面标标志物并用MTT法测定BMSC细胞生长曲线。 3.骨髓基质干细胞向成骨细胞的成骨诱导培养和鉴定 将获取的骨髓基质干细胞进行成骨诱导分化,观察其细胞形态,用钙钴法检测碱性磷酸酶活性并用茜素红染色法检测矿化结节形成情况。 4.骨纤维异常增殖症病变标本中骨髓基质干细胞Gsa基因型分析 从获取的骨髓基质干细胞提取细胞DNA,通过定向诱导突变,巢式PCR及限制性内切酶进行酶切等方法将突变基因扩增,并进行基因序列测定。 结果： 1.原代细胞呈长梭形的成纤维细胞样,细胞密集生长处呈现旋涡状,传代后细胞均呈漩涡状生长,排列整齐,多呈长梭形或多角形,进一步纯化后,细胞形态趋于长梭形。 2.99%的细胞表达CD44和HLA-ABC,不表达CD34.由生长曲线可见：传代培养的潜伏期为24h,对数生长期出现在第3-4天,5天后细胞进入平台期。 3. BMSC细胞进行成骨诱导分化后,呈现成骨细胞形态,三角形、多角形,钙-钴法行碱性磷酸酶染色,可见大部分细胞内呈阳性反应,经茜素红染色后可见有形成的钙结节。 4.颌骨FD患者的BMSC中Gsa第201位氨基酸的编码基因突变G→A或C→T,造成第201位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸或精氨酸突变为半胱氨酸突变。 结论： 1.在新鲜FD骨标本中可以成功提取BMSC,其在体外具有诱导成骨的能力,获取到的BMSC可以满足后续实验的要求。 2.颌骨FD患者BMSC中Gsa蛋白第201位氨基酸编码基因位点存在特异性突变,骨髓基质干细胞激活型Gsa基因发生错义突变是导致FD的原因 3.巢式PCR是一种检测该突变的可靠、经济的检测方法。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R782

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本文编号：2781647