SD乳鼠髁突软骨细胞在静磁场作用下的软骨分化研究

发布时间：2020-08-06 11:35

【摘要】：[目的]观察SD乳鼠下颌髁突软骨细胞(Mandibular Condylar Chond-rocytes,MCCs)在280mT静磁场作用下,其软骨分化过程中Ⅱ型胶原、IHH、X型胶原及Sox9、Runx2的表达变化,以说明静磁场对髁突软骨分化过程的影响,为深入探讨静磁场对颌面部软骨生长发育的影响及磁生物学效应的临床应用奠定理论基础。[方法]取出生2-3天SD乳鼠的下颌髁突软骨,培养原代髁突软骨细胞,纯化细胞并传代。将细胞分为空白组(MCC)和磁场组(SMC),SMC组加载280mT静磁场。采用Ⅱ型胶原免疫组化染色、甲苯胺蓝染色鉴定两组髁突软骨细胞,后将其培养至第3、8、15天,在扫描电镜下观察髁突软骨细胞表面超微形态结构。用RT-qPCR法检测静磁场对髁突软骨细胞在第3、8、15天Ⅱ型胶原、IHH、X型胶原mRNA表达的影响;用蛋白质印迹法检测加载静磁场后软骨细胞在第3、8、15天Sox9、Runx2蛋白的表达变化。[结果]1.空白组和磁场组髁突软骨细胞的Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色鉴定结果均为阳性。2.在扫描电镜下观察到,随着培养时间增加,磁场组髁突软骨细胞表面的颗粒状、疤样、纤维条索状结构以及细胞间连接均较空白组增加。3.两组髁突软骨细胞培养第3-8天,细胞外基质中Ⅱ型胶原大量分泌,而IHH、X型胶原合成较少,Sox9高表达;第8-15天,IHH和X型胶原大量分泌,Ⅱ型胶原合成减少,Runx2高表达。磁场组髁突软骨细胞Ⅱ型胶原、IHH、X型胶原及调控因子Sox9、Runx2的表达变化趋势与空白组基本一致,并且在相同时间点,磁场组的表达量均高于空白组,差异具显著性。[结论]1.在静磁场作用下,髁突软骨细胞表面的超微形态结构产生一定变化,说明静磁场可引起髁突软骨细胞内部结构的变化。2.在加载静磁场后第3-8天,髁突软骨细胞大量合成Ⅱ型胶原,细胞处于分化早期阶段,静磁场主要促进Ⅱ型胶原、Sox9的表达;第8-15天,IHH与X型胶原大量分泌,髁突软骨细胞进入肥大阶段,静磁场主要促进IHH、X型胶原及Runx2的表达。3.静磁场能促进髁突软骨细胞特异性基质分泌,促进软骨细胞的分化。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R782.6
【图文】：

静磁场,加载装置,永磁体,加载平台

永磁体静磁场加载装置（力田磁电科技有限公司，中国）逡逑高斯计（上海亨通ＨＴ２０，中国）逡逑本实验采用的永磁体静磁场加载装置（图１）由加载平台、安装座、永磁体逡逑１０逡逑

乳鼠,实验动物,所指,箭头

两组细胞在相同条件下继续培养，以后隔日更换培养液。逡逑图２邋ＳＤ乳鼠髁突软骨细胞的取材、分离逡逑（图２ａ：实验动物，出生２－３天的ＳＤ乳鼠；ｂ：箭头所指为分离逡逑解剖出的髁突软骨）逡逑２．２邋ＳＤ乳鼠髁突软骨细胞鉴定逡逑２．２．１邋ＩＩ型胶原免疫组织化学染色逡逑传一代后，调整髁突软骨细胞悬液的密度为４Ｘ１０４个／ｍｌ，吸取ｌｍｌ悬液接逡逑种在预置于培养皿中央的无菌载玻片上，在３７°Ｃ恒温、５％Ｃ０２饱和湿度培养箱逡逑内孵育。待细胞生长至５０％？６０％，取出载玻片，ＰＢＳ浸洗两次，４％多聚甲醛逡逑固定１小时，ＰＢＳ冲洗３次。０．４％的Ｔｒｉｔｏｎ邋Ｘ－１００浸泡３０分钟后ＰＢＳ冲洗３逡逑次，每次３分钟；新鲜配制的３％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶１５分钟；ＰＢＳ逡逑冲洗３次，每次３分钟；３７°Ｃ１０％正常山羊血清封闭３０分钟；滴加兔抗小鼠ＩＩ逡逑型胶原抗体，４°Ｃ过夜；３７°Ｃ复温１小时，ＰＢＳ冲洗３次，每次３分钟；辣根过逡逑氧化物酶标记抗兔二抗

甲苯胺蓝染色,乳鼠,鉴定结果

逦Ｊｂ＿逡逑图４邋ＳＤ乳鼠髁突软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定结果（Ｘ邋１００）逡逑（图４ａ：邋ＭＣＣ甲苯胺蓝染色；ｂ：ＳＭＣ甲苯胺蓝染色）逡逑２加载静磁场后ＭＣＣｓ胞体表面超微形态学结构变化逡逑在扫描电镜下观察髁突软骨细胞，发现静磁场作用第３天，细胞多呈短梭形逡逑或多边形，直径１０－２０ｕｍ左右，细胞表面有少量突起，空白组细胞表面相对光逡逑滑（图５ａ，ｂ）；第８天细胞呈类圆形，似蜂窝样表面的球体，尤其磁场组细胞体逡逑积饱满，胞体明显胀大，胞体表面突起增多，呈凹凸不平小丘状，周边出现纤维逡逑网状结构，排列相对规则（图５ｃ，邋ｄ）；第１５天，细胞表面明显可见大量的微绒毛逡逑状、层状、疤样结构，更为凹凸不平，表面颗粒状物质减少，并可见纤维状条索逡逑结构变粗大，不规则排列（图５ｅ，邋ｆ）。相同时间点的磁场组髁突软骨细胞胞体表逡逑面突起以及细胞间连接均较空白组细胞多。逡逑ＢＤ逡逑１５逡逑

【参考文献】