不同部位来源的牙周膜干细胞成骨能力的动物实验研究

发布时间：2020-08-07 02:33

【摘要】：牙周病是牙周组织的一种感染性疾病,据统计,我国有2/3的人患有牙周疾病,是40岁以上人群牙齿缺失的主要原因。它是发生在牙周支持组织的疾病,包括牙龈,牙骨质,牙周膜,牙槽骨的吸收,破坏和丧失,而后期发展为牙周病则会引起牙齿松动、移位,咀嚼无力甚至疼痛,最终导致牙齿的脱落脱落和拔除。牙周病治疗的目标是去除牙周刺激因素,阻止进一步的牙周附着丧失最终获得牙周软硬组织的再生,其中以牙槽骨的修复再生最为关键。目前临床广泛使用的引导组织再生术虽然对治疗牙周病有一定的积极意义,可是还不能够使牙周组织得到完全修复和再生,缺损部位的组织进行自身修复能力有限。如何实现有效的牙周再生,是学着们一直追求的目标和努力的方向。利用组织工程学研究组织再生的主要内容包括种子细胞的来源,生物载体支架的选择以及微环境的构建等三个方面。其中种子细胞的优化选择研究是牙周再生领域组织工程的重要内容之一。通过牙周膜中的不同细胞亚群的定向迁移和分化,牙周组织具有一定的自我修复能力实现。近年来,Seo BM等在健康成人牙周膜单细胞悬液中利用酶消化法分离得到具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞,命名为牙周膜干细胞,为治疗牙周病提供了新的方法和思路。牙周膜是连接牙齿和牙槽骨韧带组织,拔牙时牙周膜断裂,在牙齿和牙槽窝内都残留有牙周膜干细胞。那么,拔牙后,牙根表面的牙周膜干细胞和牙槽窝内残留的牙周膜干细胞否有所不同?他们对牙周再生的作用和效果是否一样?在应用组织工程学的方法作为种子细胞进行牙周再生的时候,究竟什么位置的牙周膜干细胞更加有效?对于这些问题的研究和回答,无疑将有助于为今后牙周组织再生种子细胞的优化选择打下理论基础,进一步推动运用组织工程的方法治疗牙周疾病的效果。本课题分两部分,前期主要涉及牙槽窝来源的牙周膜干细胞性质和特点的体外鉴定,而本人主要是利用动物实验的方法研究关于牙槽窝来源的牙周膜干细胞体内成骨能力。主要内容和结果如下: 1、人不同部位来源牙周膜干细胞裸鼠皮下成骨能力的研究首先是两种不同部位来源的PDLSCs的分离和培养。在拔牙后牙槽窝挂取残留牙周膜组织,通过组织块加酶消化法,培养出牙槽窝表面牙周膜表面牙周膜干细胞a-PDLSCs(alveolar bone surface periodontal ligament stem cells);用文献所述的方法,在拔牙后牙根中1/3段挂取牙周膜组织,同样使用组织块加酶消化法,培养出牙根表面牙周膜干细胞r-PDLSCs(root surface periodontal ligament stem cells)。经过间接免疫磁珠法纯化两种来源的PDLSCs。分别在体外用成骨诱导液进行矿化诱导,两周后用分别观察发现均可形成矿化结节。通过对茜素红染色形成的矿化结节定量分析,发现a-PDLSCs体外矿化结节面积大于r-PDLSCs体外矿化结节的面积,a-PDLSCs矿化结节面积占视野的8.54%,而r-PDLSCs矿化结节面积占视野的3.21%,说明a-PDLSCs体外诱导后成骨能力明显强于r-PDLSCs。接着再将两种来源PDLSCs分别于CBB复合后,移植入裸鼠皮下,观察6周,发现来源于牙根面的r-PDLSCs形成了典型的牙周膜/牙骨质复合体样结构;而来自于牙槽窝表面的a-PDLSCs主要以骨样矿化组织为主,可见明显的骨细胞存在于类骨样矿化组织中。本实验说明虽然都是来源于牙周膜组织,但是牙根面的r-PDLSCs与牙槽窝表面的a-PDLSCs在体外成骨诱导能力上不一样,a-PDLSCs有着更强的矿化能力;而在体内,a-PDLSCs也能够表现出更强的成骨能力。 2、人不同部位来源牙周膜干细胞修复裸鼠颅骨极限缺损能力的研究在实验第一部分基础上,得到纯化的a-PDLSCs和r-PDLSCs。利用免疫缺陷小鼠,建立其颅骨极限缺损模型,直径大小为6mm。利用纤维蛋白凝胶作为支架材料,分别复合两种来源牙周膜干细胞,植入裸鼠颅骨缺损部位,同时将单纯不复合种子细胞的纤维蛋白胶作为空白对照组。通过术后0周,5周及10周拍摄Micro-CT及10周后取材进行HE切片组织学观察。术后5周, r-PDLSCs及a-PDLSCs颅骨缺损部分均有不同程度的修复,修复面积分别达到19%左右和32%左右,而空白对照组几乎没有任何新骨生成。术后10周,r-PDLSCs及a-PDLSCs组修复面积百分比较5周时更多,a-PDLSCs组可达51%左右,而r-PDLSCs组能够修复36%左右。面积更大的高密度新生骨在缺损区域的边缘和中间部分同时出现,新生骨密度更加接近正常骨。 10周后取材,HE切片观察,发现r-PDLSCs及a-PDLSCs组均有大面积新骨形成,成骨细胞清晰可见,而空白对照组几乎没有新骨形成。本实验r-PDLSCs具有新骨诱导形成的能力,但是a-PDLSCs具有更强的新骨形成能力,在相同时间内可更快更好的完成颅骨极限缺损的修复。是理想的骨组织工程种子细胞。 3、比格犬自体不同部位来源牙周膜干细胞介导治疗牙周缺损的研究牙周病治疗的最终目的就是实现完全的牙周组织再生。本实验利用自体不同来源的牙周膜干细胞,在雄性比格犬上颌尖牙区域制作牙周缺损模型,去除颊侧及近中侧牙槽骨和牙周膜,平整牙根面后,利用纤维蛋白凝胶作为支架材料,分别复合r-PDLSCs及a-PDLSCs,移植入缺损区域,利用双源CT观察牙槽骨再生情况。在术后5周, r-PDLSCs及a-PDLSCs牙周缺损部分均有不同程度的修复和再生,而空白对照组几乎没有,r-PDLSCs及a-PDLSCs牙槽骨再生的高度有明显区别。r-PDLSCs组牙槽嵴高度约恢复了30%,而a-PDLSCs组牙槽嵴高度恢复了约50%,大于r-PDLSCs组。缺损边缘和中间部分都可见有新生骨形成,密度相对于正常骨稍低,边缘区域新生骨和正常骨有融合。术后10周,r-PDLSCs及a-PDLSCs组牙槽嵴高度恢复均较5周时更多,r-PDLSCs组可达60%左右,而a-PDLSCs组几乎完全恢复。同时新生牙槽骨骨密度更加接近正常骨。本实验说明在原位用自体r-PDLSCs及a-PDLSCs修复牙周缺损的时候,两种不同部位来源的PDLSCs都具有是牙槽骨再生的能力,但是在相同时间内,来源于牙槽窝表面的a-PDLSCs具有更强的骨再生能力。通过本研究,有望于在进一步的临床工作中,使用牙根面来源的人自体a-PDLSCs作为牙周组织工程种子细胞,使因为牙周病而受到损害的牙周组织进行完全的牙周组织再生,为牙周组织工程种子细胞的优化选取开辟新的途径。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R781.4
【图文】：

来源,动物实验研究,博士学位论文,牙周膜

不同时间点两种来源PDLSCs修复裸鼠颅骨极限缺损面积百分比

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43图 6B 不同时间点两种来源 PDLSCs 修复裸鼠颅骨极限缺损面积百分比2.2.1 方差分析（Univariate Analysis of Variance）0 周、5 周、10 周不同部位 PDLSCs 修复裸鼠颅骨缺损方差分析

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图 7 A 不同时间点两种来源 PDLSCs 修复裸鼠颅骨极限缺损面积百分比方差分析方差分析结果:不同组别间比较 F=24.925，p=0.000不同时间点间比较 F=34.539，p=0.0002.2.2 多重比较（multiple comparison）采用 LSD 法进一步对不同组别间的差异进行多重比较图 7 B 不同时间点两种来源 PDLSCs 修复裸鼠颅骨极限缺损面积百分比多重比较

【参考文献】