人牙髓细胞外泌体的提取与鉴定

发布时间：2020-08-08 14:50

【摘要】：研究目的:体外无血清或去外泌体血清条件培养人牙髓细胞(hDPCs),分别采用差速离心法和ExoQuickTC试剂盒法分离提取人牙髓细胞来源的外泌体并进行鉴定,对获取外泌体的细胞培养方法和提取方法进行比较,探索获取人牙髓细胞外泌体的最佳细胞培养条件和提取方法。研究方法:1、收集临床上因正畸拔除的前磨牙(12~26岁),组织块贴壁法体外培养hDPCs,免疫组织化检测波形丝蛋白和角蛋白的表达。2、选取第4-6代hDPCs,分别用10%无外泌体血清条件培养基和无血清条件培养基培养48h;3、收集细胞培养的上清液分别采用差速离心法和ExoQuick TC试剂盒法提取外泌体,共获得四种不同来源和提取方法的外泌体,分别为:⑴试剂盒无外泌体血清组(Kit-血清-hDPCs-DEs);⑵试剂盒无血清组(Kit-hDPCs-DEs));⑶差速离心无外泌体血清组(UL-血清-h DPCs-DEs);⑷差速离心无血清组(UL-hDPCs-DEs);4、外泌体的鉴定包括:⑴形态鉴定,采用透射电镜观察提取外泌体的形态;⑵外泌体标志蛋白检测,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测CD63表达量,蛋白印记法定性分析外泌体标志蛋白CD9。实验结果:1、组织块贴壁法培养人牙髓细胞传至第三代后细胞呈长梭形,大小均一,成纤维细胞形态。免疫组织化学染色结果显示,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,提示所培养的人牙髓细胞为间充质来源。2、人牙髓细胞在无血清培养基条件下的生长:生长良好的P3-6代hDPCs更换至无血清条件培养基中培养48小时,镜下见hDPCs形态拉长,排列疏松,细胞三维结构塌陷;3、人牙髓细胞在无外泌体血清培养基条件下的生长:10%无外泌体血清条件培养基中培养hDPCs 48小时,细胞形态均一,胞质饱满,细胞增殖良好,排列紧密呈旋涡状生长。4、外泌体的提取:差速离心法和ExoQuickTC试剂盒法均可分离出直径在50-100nm之间,膜性结构包裹的外泌体囊泡,差速离心法分离的外泌体可观察到囊泡破裂的现象;5、外泌体的鉴定和提取浓度测定:⑴ELISA检测CD63的表达,结果显示四组细胞培养上清提取物均表达CD63;采用差速离心方法获取的外泌体浓度为:无外泌体血清hDPCs培养上清液提取的外泌体(UL-血清-h DPCs-DEs)浓度为:(2.5±0.2)×10~8particles;无血清hDPCs培养上清液获得外泌体(UL-h DPCs-DEs)浓度为(0.8±0.1)×10~8particles;UL-血清-h DPCs-DEs的浓度高于UL-hDPCs-DEs组,差异有统计学意义(p0.05)。ExoQuickTC试剂盒法获取的外泌体浓度为:无外泌体血清hDPCs培养上清液获得的外泌体(Kit-血清-h DPCs-DEs)浓度为(18.5±4.2)×10~8particles;无血清hDPCs培养上清液获得外泌体(Kit-hDPCs-DEs)浓度为(4.22±2.64)×10~8particles;Kit-血清-hDPCs-DEs组浓度高于Kit-hDPCs-DEs组,差异有统计学意义(p0.05)。Kit-血清-hDPCs-DEs高于UL-血清-hDPCs-DEs组,差异有统计学意义(p0.05);Kit-hDPCs-DEs组浓度与UL-hDPCs-DEs组相比,差异无统计学意义(p0.05)。⑵WB检测外泌体标志蛋白CD9,结果显示,无外泌体血清培养条件上清提取物CD9为阳性表达,UL-血清-h DPCs-DEs的表达最强,Kit-血清-hDPCs-DEs的表达较弱。而无血清培养的上清提取物未能检测到CD9的表达。结论:与无血清培养条件相比较,10%无外泌体血清培养基更利于hDPCs的生长和细胞分泌产生外泌体;ExoQuick TC试剂盒法用较少量的上清即可获得外泌体,但提取的外泌体纯度较低。差速离心法可提取纯度较高的外泌体,但存在有外泌体囊泡破裂的情况。结果提示采用10%无外泌体血清培养基进行细胞培养可促使牙髓细胞分泌外泌体,提取的方法可根据研究目的进行选择。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R78
【图文】：

波形丝蛋白,旋涡状,细胞大小,牙髓组织

髓细胞外泌体的提取与鉴定硕士学位论文. 结果1 hDPCs 的培养与鉴定人牙髓组织块接种至培养瓶后约 5-10 天，可在倒置相差显微镜下观察牙髓组织周围有长梭形或星型的细胞爬出，细胞呈光晕状（图 1-1，A），胞爬出约 2 周后，细胞融合至 80%，进行原代细胞的首次传代。传代后续培养至第三代，细胞大小均一，成纤维细胞样形态稳定，紧密排列或旋涡状生长，有胞浆凸起互相连接（图 1-1，B）。免疫组化染色结果显，波形丝蛋白染色阳性（图 1-1，C）和角蛋白染色阴性（图 1-1，D）图 1-1 人牙髓细胞的培养和鉴定

无血清,细胞形态,血清,三维结构

growth with cytoplasmic projections connected to each other (×40-fold); C, vimentinimmunohistochemistry after staining, hDPCs were positive (×200-fold); D, keratin immunohistochemistryafter staining, hDPCs were negative (×200-fold).2.2 不同培养条件下细胞生长情况更换条件培养基后连续培养 48h，显微镜下观察到，无血清条件下培养的 hDPCs 呈饥饿状态，细胞形态拉长，胞体细长皱缩，排列稀疏，生长缓慢，部分细胞三维结构塌陷（箭头所示三维结构塌陷的 hDPCs），甚至死亡（图 1-2，A）；10%无外泌体血清条件下培养的 hDPCs 呈长梭形，细胞基质饱满,细胞排列紧密，呈旋涡状生长（图 1-2,B）。图 1-2：hDPCs 在无血清条件下和 10%无外泌体血清条件下的细胞形态A、hDPCs 在无血清条件培养基下培养 48h 后，细胞形态拉长，排列疏松，箭头所示细胞三维结构

透射电镜,双层膜结构,血清,电镜

.1 外泌体的形态学观察.1.1 ExoQuick TC 试剂盒法ExoQuick TC 试剂盒法提取外泌体较少量的培养上清液即可获得比离心法更多的沉淀。采用试剂盒法从无血清培养的细胞上清液和 10%泌体血清培养的细胞上清液中提取的外泌体，在透射电镜下均可观察性结构的外泌体囊泡，但样品背景杂质较多，（图 2-1A、B）。其中清-hDPCs-DEs 组中可见典型的茶托状结构的膜性囊泡，结构完整，单多个外泌体囊泡聚集叠加（如图 A 箭头所示）。在 Kit- hDPCs-DEs 组体数量少，形态不典型，囊泡偏小，膜性结构完整（图 2-1 B 箭头所示

【参考文献】