实验性咬合紊乱致大鼠TMJ髁突骨关节炎样变及Cx43半通道在关节软骨退变中的作用

发布时间：2020-08-12 23:54

【摘要】：颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorder，TMD）是一种常见的口腔颌面部疾病，与咬合的关系十分密切，颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular jointosteoarthritis，TMJ OA）是其中最为严重的一种。骨关节炎（osteoarthritis，OA）的病理改变主要包括以软骨细胞凋亡增加、软骨基质降解、炎性因子和基质金属蛋白酶合成增加为主的软骨退行性变；以及软骨下骨早期的骨吸收改变到后期骨硬化，骨赘形成等。然而，关于颞下颌关节骨关节炎中髁突软骨下骨的病理改建及启动OA早期关节软骨退行性变化的分子机制尚不清楚。近年来我课题组根据一系列临床研究结果，创建了高仿真的异常咬合导致TMJOA样变的大鼠模型。在本研究中，我们首先采用包括活体micro-CT、组织形态学分析、实时定量PCR、免疫组织化学染色等研究手段，观察长时间实验性后牙咬合紊乱导致TMJ OA大鼠模型软骨下骨的动态改建过程以及成骨细胞和破骨细胞的活性在此改建中的变化；其次，建立了实验性单侧前牙反牙合大鼠模型，并以形态学方法评价该模型大鼠TMJ OA病变的特征，确定该模型具有更加严重的OA样病变及其作为TMJ OA研究模型的可靠性。最后，以此单侧前牙反牙合模型为基础，采用细胞加载（剪切力）、荧光染料摄取、siRNA干扰、ELISA和western blot等技术，研究在异常受力情况下，软骨细胞膜上Cx43半通道在软骨退变中的重要作用。研究结果： 1．在后牙咬合紊乱大鼠模型中，从实验开始第8周起便可检测到软骨下骨的吸收，并在实验12周时达到最大值，之后骨吸收开始减少，并一直持续到实验后32周的观察期内。实验后期骨量开始增加，但是这种新生骨的力学性能较对照组差，且骨矿物质密度较低。实验12周组TRAP阳性的破骨细胞数量较同龄对照组明显增多，而在实验12周组和实验32周组表达osteocalcin的成骨细胞数量均多于对照组。TRAP和cathepsin K mRNA的表达在12周实验组显著增加，而ALP和osteocalcinmRNA的表达在12和32周两个时间点均显著增加。 2．为观察以退行性变为主的髁突OA样变，我们设计了单侧前牙反牙合的大鼠模型，在实验后2周、4周和8周进行micro-CT扫描和实时定量PCR检测。于实验后2周便观察到明显的软骨下骨的骨吸收，表现为micro-CT显示的骨矿物质密度和骨体积分数（BV/TV）明显下降，与破骨相关的因子如RANKL、RANKL/OPG、RANK、TRAP和cathepsin K的mRNA的表达水平在2周、4周和8周均显著增加，而与成骨相关的因子osterix、RUNX2、ALP、osteocalcin的表达在2周时明显降低，而在4周和8周高于对照组水平。并在骨—软骨交界处观察到明显的钙盐沉积，提示存在成熟软骨层的异常钙化。 3．为探讨异常咬合导致TMJ OA样变的分子机理，我们以实验性单侧前牙反牙合大鼠为研究对象进行一系列体内外检测。体内研究结果表明，实验后2周、4周和8周大鼠TMJ髁突软骨中力敏感半通道蛋白Cx43mRNA表达增加，软骨细胞合成和分泌PGE_2的功能增强；体外结果显示，大鼠髁突原代软骨细胞在受到剪切力刺激下，Cx43表达增加，Cx43半通道开放程度增大，PGE_2合成和分泌增加，并且PGE_2的分泌可被半通道阻断剂所抑制；在剪切力刺激下，小鼠ATDC5软骨样细胞也可观察到类似的变化，并且在给予siRNA干扰Cx43表达后，观察到PGE_2的分泌明显减少，而合成量并无明显改变。由此得出以下结论： 1．咬合紊乱作用下，可导致TMJ髁突出现明显的软骨下骨病理改建，早期以骨吸收为主，晚期出现明显的骨形成修复反应，但是新形成骨的骨质不佳。 2．异常咬合刺激加强，可致软骨下骨吸收程度加重、出现时间更早，并伴有成熟软骨区域的异常钙化。 3．异常咬合导致颞下颌关节髁突软骨出现退行性变的重要机理之一是髁突软骨细胞受到了异常生物力的刺激，异常生物力作用可使髁突软骨细胞表达Cx43的水平提高，Cx43半通道开放程度增加，PGE_2合成和分泌能力增强，从而引起软骨一系列退行性改变。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R782.6
【图文】：

髁突,时间顺序,活体,大鼠

-33-图 1-1A．大鼠 TMJ 髁突活体 micro-CT 三维重建图像，从左至右按照第 0 周~32 周的时间顺序排列。其中，实验组（EXP）可观察到软骨下骨局部骨吸收现象，相较于其他时间点，实验后 12 周骨吸收程度达到最大（箭头所示）。B．测量髁突头宽径（a-b）和长径（c-d）示意图。（a）髁突头内侧面的最高点，（b）髁突头外侧面的最高点，（c）髁突头前面的最高点，（d）髁突头后面的最高点。C．Micro-CT 分析时选择 ROI 示意图，将髁突头表面三等分，ROI 分别位于中部和后部。

骨吸收,实验组,分析显示,髁突软骨

图 1-2A．Micro-CT 分析显示实验组在 8 周时开始出现明显的骨吸收，并在 12 周达到最大值。B．12 周、32 周组大鼠 TMJ 髁突正中矢状切片的 HE 染色，黑框内为组织形态学分析的选择区域。C．组织形态学分析显示软骨下骨的骨吸收情况（*p<0.05，**p<0.01）。3.2 破骨细胞活性对照组大鼠髁突软骨下骨中 TRAP 阳性细胞分布很少，12 周实验组大鼠髁突软骨下骨中的 TRAP 阳性细胞较对照组显著增加（p<0.01），32 周实验组大鼠髁突软骨下骨中的 TRAP 阳性细胞则回归到对照组水平（图 1-3B）。实时定量 PCR 结果显示，与同龄对照组相比较，在 12 周和 32 周实验组髁突软骨下骨中，RANKL mRNA 的表达显著增加，而 OPG mRNA 表达则显著下降，从而使得 RANKL/OPG 显著增加（p<0.05，图 1-3C）。实验组中 TRAP 和 cathepsin K mRNA的表达在 12 周显著升高，而在 32 周时回落到对照组水平（p<0.05，图 1-3C）。

髁突软骨,大鼠

-35-图 1-3A．大鼠 TMJ 髁突软骨下骨 TRAP 染色。B．计数 TRAP 染色阳性且细胞核多于 3 个为破骨细胞（Oc.N）。C．实时定量 PCR 检测 TMJ 髁突软骨下骨中的 RANKL、OPG、TRAP 和 cathepsin KmRNA 的表达（*p<0.05，**p<0.01）。3.3 成骨细胞活性Osteocalcin 染色阳性细胞主要分布在大鼠髁突软骨下骨骨小梁的表面，与对照组相比，12 周和 32 周实验组软骨下骨中的 osteocalcin 阳性细胞数量明显增加（p<0.01，

【共引文献】