熊果酸对人舌癌Tca8113细胞增殖、凋亡的影响及机制的实验研究

发布时间：2020-08-15 00:04

【摘要】：口腔癌是最常见的十大恶性肿瘤之一,而在我国口腔癌中,舌癌的发病率居第一位。舌癌生长快,恶性程度高,浸润性较强。治疗方法常是手术、放疗、化疗等的综合治疗,但患者的五年生存率仍然很低,探寻积极有效的预防途径及有效的治疗药物显得十分迫切和必要。 熊果酸对多种致癌、促癌物有抵抗作用。体外实验证实其可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡。而熊果酸对口腔肿瘤的作用研究较少,而其对舌癌作用机制的研究,国内外尚不多见。 采用体外培养人舌癌Tca8113细胞的方法,观察熊果酸对其产生的作用。在此基础上,采用MTT法,流式细胞术、电镜观察、免疫细胞化学技术、及RT-PCR、Western Blot等多种分子生物学技术观察熊果酸对Tca8113细胞增殖、凋亡的影响并探讨其发生机制。在体外实验的基础上,以Tca8113细胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,应用适当浓度的熊果酸进行治疗,观察熊果酸经体内代谢后对肿瘤的影响以及荷瘤裸鼠的毒性反应,并探讨其发生机制,为舌癌的治疗寻找新的药物,拓展新的思路和方法,为熊果酸在口腔癌治疗中的开发、应用提供实验依据。本研究分为以下三个部分： 第一部分熊果酸对人舌癌Tca8113细胞增殖的影响及促凋亡作用 方法 1.光学显微镜观察未经和经熊果酸作用的Tca8113细胞的形态学变化。 2.经浓度为6.25、12.5、25、50μmol/L熊果酸培养液作用于人舌癌Tca8113细胞,分别培养12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl terazolium, MTT)比色法,检测Tca8113细胞增殖活性的改变,观察不同浓度熊果酸作用不同时间后对人舌癌Tca8113的毒性效应。 3.将浓度25μmol/L熊果酸培养液作用于人舌癌Tca8113细胞,分别培养0、24、48、72h后,应用流式细胞术(Flow CytoMeter, FCM)在功能水平上检测人舌癌Tca8113细胞的凋亡率及细胞周期分布情况。 4.应用透射电镜观察经25μmol/L熊果酸作用72h的细胞超微结构变化 5.统计学处理：采用统计学软件SPSS13.0对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差(x±s)表示。MTT法检测结果采用两因素方差分析,流式细胞术结果采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。 结果 1.经熊果酸作用后的Tca8113细胞发生了形态学变化。 2.熊果酸对Tca8113细胞有明显的生长抑制作用,呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性；不同浓度组间、不同时间组间生长抑制率均有显著性差异(p0.01)。50μmol/L熊果酸作用72h后细胞生长抑制率达68.80%。 3.流式细胞术结果显示,随熊果酸作用时间延长,Tca8113细胞凋亡率由2.57%增加至24.51%,有统计学意义(p0.01)。G2/M期细胞比例变化不明显(p0.05),而S期细胞比例逐渐降低(p0.01),G0/G1期细胞比率明显升高(p0.01)。 4.透射电镜显示熊果酸作用后,细胞骨架破坏,核染色质浓缩成块,同时可见凋亡小体。 第二部分熊果酸促人舌癌Tca8113.细胞凋亡的作用机制 方法 1.分别制作经浓度25μmol/L熊果酸作用0、24、48、72h的细胞爬片,采用免疫细胞化学技术检测细胞NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax基因蛋白表达情况。 2.将25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113细胞0、24、48、72h后,应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测药物作用后的Tca8113细胞中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表达情况,并对检测结果进行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌细胞增殖及其促其凋亡的机制。 3.将25μmol/L熊果酸作用于人舌癌Tca8113细胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法检测药物作用后的Tca8113细胞中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步研究熊果酸抑制舌癌细胞增殖及其促其凋亡的机制。 4.统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。 结果 1.免疫细胞化学染色结果：NF-κB棕黄色着色在细胞核和细胞浆内；VEGF棕黄色着色在细胞质内；Bc1-2、Bax棕黄色颗粒在细胞质内。 2. RT-PCR结果：经熊果酸作用后,Tca8113细胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因mRNA表达逐渐降低,Bax细胞因子mRNA表达逐渐升高,Bc1-2/Bax比例降低,且有时间依赖性。有统计学意义(p0.05)。 3. Western blot检测结果：经熊果酸作用后,Tca8113细胞的NF-κB、VEGF、Bc1-2基因蛋白表达逐渐降低,Bax蛋白表达逐渐升高,且有时间依赖性。有统计学意义(P0.05)。 第三部分熊果酸治疗荷瘤裸鼠的体内实验研究 方法 1.选用4-6w龄的BALB/C-nu/nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接种Tca8113细胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分为对照组和实验组,每组6只,实验组每d向肿瘤组织局部注射熊果酸,剂量为0.05mg/g体质量；对照组注射同体积PBS(0.01M,pH7.4)。共治疗4w。 2.每d观察裸鼠的精神、饮食及活动状况。每w测量瘤体大小及裸鼠体重,进行药物毒性评价。 3.治疗结束时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑瘤率。 4.光学显微镜下观察肿瘤组织及脑、心、肝、脾、肾等重要脏器。 5.应用RT-PCR技术检测移植瘤中NF-κB、VEGF、bc1-2和Bax的mRNA表达情况,并对检测结果进行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌细胞移植瘤机制。 6.采用Western Blot方法检测移植瘤中NF-κB、VEGF、Bc1-2和Bax基因蛋白表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步研究熊果酸抑制舌癌细胞移植瘤增殖及其促其凋亡的机制。 7.采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数。 8.统计学处理：采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差(x±s)表示。裸鼠体质量变化及瘤体质量变化分别采用独立样本的t检验和配对t检验。RT-PCR及Western Blot采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。 结果 1.与对照组相比,实验组肿瘤生长缓慢,随注射熊果酸时间增长,肿瘤被抑制效果更加明显。到治疗结束时,两组裸鼠移植瘤体积、瘤质量均存在显著性差异(p0.05)。瘤质量及瘤体积抑制率达到55.65%和61.72%。 2.治疗过程中,裸鼠未见明显不良反应,治疗结束时,各组裸鼠体质量与治疗前体质量相比增加平稳,比值大于0.8,未见明显毒性反应。两组裸鼠的重要脏器脑、心、肝、脾、肾等均未见器质性改变及瘤转移等。 3.光学显微镜下,实验组肿瘤内组织坏死崩解的面积明显大于对照组,细胞形态的异形性比对照组小,可见核固缩等凋亡现象。 4. RT-PCR技术检测移植瘤中NF-κB、VEGF、bcl-2 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调,有统计学差异(P0.05)。 5. Western Blot方法检测移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下调,Bax基因蛋白表达上调,有统计学意义(p0.05)。 6.与对照组相比,实验组肿瘤组织中凋亡细胞明显增多,两组AI分别为：1.63±0.30,17.39±2.78,组间有显著性差异(p0.05)。 结论 本研究前两部分采用MTT方法、流式细胞术及电镜技术检测熊果酸对人舌癌Tca8113细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响,采用免疫细胞化学技术、RT-PCR技术以及Western Blot免疫印迹等分子生物学技术检测了熊果酸对人舌癌Tca8113细胞基因NF-κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达的影响。第三部分采用上述部分方法进行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的检测,得出如下结论： 1.熊果酸对人舌癌Tca8113细胞具有增殖抑制作用,并且呈时间剂量依赖性。 2.熊果酸对人舌癌Tca8113细胞具有诱导凋亡作用,并且存在时间依赖性。 3.熊果酸能下调人舌癌Tca8113细胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2 mRNA以及蛋白表达,能上调Bax表达,改变了Bc1-2/Bax的比例,且具有时间依赖性。此作用可能是其抑制细胞增殖的机制之一。 4.熊果酸参与Tca8113细胞周期调控,使细胞阻滞于G0/G1期。熊果酸对细胞的增殖抑制、诱导凋亡及相关基因的抑制作用可能均与其G0/G1期阻滞有关。 5.成功构建了人舌癌Tca8113细胞裸鼠移植瘤模型,证实熊果酸能抑制舌癌移植瘤生长,且对机体无明显毒、副作用。 6.与体外实验结果相似,熊果酸能下调舌癌裸鼠移植瘤NF-κB、VEGF、Bc1-2 mRNA以及蛋白表达,上调Bax mRNA及蛋白表达。诱导细胞凋亡,抑制移植瘤生长。本研究为熊果酸的临床应用提供一定的参考资料。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.8
【图文】：

中芄鉿岫匀松喟?Tcas113细胞增殖的影响及促凋亡作用用时间延长、浓度升高，抑制程度增加(见表1一1，图1一1)。其中25四o1/L浓度组已具有较强抑制作用，48小时将近达到半数抑制率。因此，本研究其他相关实验均选用 25omol/L浓度的熊果酸用作实验。3.流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期变化流式细胞双标检测显示，熊果酸作用0h(对照组)、24、48、72h可见凋亡逐渐增加。其凋亡比例(见表1一2，图1一2一1一3)，随药物作用时间延长，出现少数坏死细胞。电镜下可见熊果酸作用后肿瘤细胞核碎裂，细胞质充满了空泡。流式细胞检查细胞周期显示，25omol/L熊果酸作用0h(对照组)、24、48、72h可见

治疗结束时，两组裸鼠瘤质量有显著性差异(t=23.327汗代0.01)。体积抑瘤率和质量抑瘤率分别达61.72%和55.65%(Z人(0.01)。表明熊果酸能有效抑制舌癌移植瘤的生长(见表3一1一3一2;图3一1，3一2;照片3一1)。熊果酸毒性评价:整个治疗过程中，裸鼠精神状态可，生长发育、饮食、活动均未见明显异常，表明熊果酸毒性反应小。治疗结束时两组裸鼠体重未见明显差异(见表3一3)。

llllllllllllllllllllll尸尸.~一-，....1--匕匕图3一1不同治疗时间肿瘤体积比较Fig3一 1ComparisonoftumorvolumatvarianttimePointsaftertreatment表3一2治疗前后各组裸鼠体质量变化(Table3一 2Bodymassehangesofthenudemieein beforeandafterthetreatment万士s，n=6) twogrouPsbetween组别治疗前体质褚_(g)治疗后体质址(g)对照组19.7;1土 1.262567士1.12实验织19.58士1.2飞25.87土1

【参考文献】

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本文编号：2793720