乏氧对人牙周韧带成纤维细胞基质金属蛋白酶mRNA表达的影响

发布时间：2020-08-15 07:37

【摘要】：目的：结合上皮的根方迁移以及牙周韧带胶原纤维的降解导致牙周袋的形成是慢性牙周炎形成的主要特征之一。近年研究表明,在病理状态下,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase MMPs)合成分泌增加,活性增强,导致牙周韧带、牙槽骨内的胶原纤维降解。因此,MMPs在牙周病的发病过程中起着关键作用。牙周炎、合创伤与吸烟都可以造成局部牙周组织的乏氧。乏氧环境对组织细胞有着重要的生物学影响,那么,乏氧是否影响该细胞对在牙周病时牙周组织破坏密切相关的MMPs/TIMPs的分泌从而在牙周病的病程中发挥重要作用,目前尚不清楚。因此本实验旨在乏氧环境下培养牙周膜细胞,模拟相当于牙周膜组织局部缺血的病理模型,探讨乏氧对牙周韧带成纤维细胞MMPs mRNA表达的影响,这将对缺氧状态下的牙周炎病理发病过程以及治疗方法的选择具有重要意义。方法： 1.人牙周韧带成纤维细胞的分离培养及鉴定选取山东大学口腔医院口腔颌面外科门诊就诊的10～20患者,向患者及家属说明用途并征得同意后,搜集无龋坏、牙周组织健康的前磨牙,牙根已发育完成。牙齿拔除后立即放入含有双抗的D-Hank液中保存。转运到事先消毒好的超净台内,经瓶内牙齿用含有双抗的D-Hank液充分冲洗三次,无菌条件下用手术刀刮取牙根中下部分的牙周膜组织,采用组织块法进行人牙周韧带细胞的原代培养,细胞增殖达培养瓶面积的90%后细胞传代,第3代细胞用于细胞来源鉴定,第5代细胞用于实验。ABC法免疫组化染色鉴定人牙周韧带成纤维细胞的来源。 2.实验分组常氧组(对照组)：人牙周韧带成纤维细胞在20%O2、5%CO2、75%N2的37℃培养箱中培养；乏氧组：牙周膜细胞分三组在1%O2、5%CO2、94%N2的37℃培养箱中分别培养12h,24h和48h。 3.RT-PCR检测人牙周韧带成纤维细胞MMPs和TIMPs的表达将生长状况良好的第5代细胞接种于6孔培养板中,在乏氧和常氧条件下培养。在12h,24h,48h各取一块6孔板,每个培养皿的细胞加2ml PBS冲洗2次,弃掉冲洗液。每个培养孔加入1mlTrizol,吹打,收集裂解液,-80℃低温保存,备用。Trizol两步法分别提取细胞总RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMP-1,MMP-2,MMP-9,MMP-13,TIMP-1, TIMP-2的基因表达情况,并用软件进行半定量分析。结果：1.乏氧12h,24h,48h人牙周韧带成纤维细胞MMP-2,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表达高于对照组；乏氧48h MMP-1mRNA的表达高于对照组。2.乏氧组MMP-2mRNA的表达呈明显递增趋势,与对照组相比差异具有显著性(P0.01)。3.乏氧12h组MMP-1mRNA表达有一过性降低,随着乏氧时间延长,其表达增加。乏氧12h组与常氧组相比差异无统计学意义。4.乏氧12h组TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA表达有一过性升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。随着乏氧时间延长,其表达与对照组相比增加不明显。乏氧组内TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA的表达呈递减趋势。5.实验中未检测到MMP-9,13mRNA的表达,结果未显示。6.乏氧48h后MMP-1/TIMP-1mRNA的比值变化较常氧组不明显,但乏氧12h组MMP-1/TIMP-1mRNA的比值明显降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。乏氧组组内MMP-1/TIMP-1mRNA的比值变化显著,表达呈明显递增趋势。7.乏氧12h,24h,48h组MMP-2/TIMP-2mRNA的比值较常氧组明显上升,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论：乏氧可以导致MMP-1,MMP-2,TIMP-1,TIMP-2的表达,并使MMP-2/TIMP-2的表达失衡,推测MMP-2/TIMP-2表达失衡途径可能是乏氧导致牙周炎时牙周组织破坏加重的机制之一
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2

【参考文献】