HIF-1α基因沉默对口腔癌CEACAM1和VEGF-C表达及脉管生成影响的研究

发布时间：2020-08-19 16:55

【摘要】： 实验目的： 1.观察研究HIF-1α在口腔鳞状细胞癌中表达及与CEACAM1、VEGF-C表达的关系,分析CEACAM1对血管和淋巴管生成的影响,初步探讨HIF-1α、CEACAM1、VEGF-C在口腔癌血管和淋巴管生成中的作用及可能的机制。 2.观察RNAi基因沉默HIF-1α对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113表达HIF-1α的影响,并观察研究HIF-1α基因沉默对CEACAM1和VEGF-C表达的影响,探讨HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C的调控关系及在肿瘤脉管生成中的作用机制。 3.以口腔癌裸鼠移植瘤模型为研究对象,研究HIF-1α基因沉默对肿瘤CEACAM1和VEGF-C表达的影响,验证HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C对肿瘤血管和淋巴管生成的作用,以及对肿瘤增殖和进展的影响；探讨HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C通路对肿瘤脉管生成及其正常化的影响及作用机制。研究方法： 1.以人口腔鳞状细胞癌为研究对象,检测人口腔鳞状细胞癌中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C表达收集2005-2007年山东大学齐鲁医院和山东大学口腔医院口腔癌手术标本91例,其中包括舌鳞状细胞癌标本30例。患者临床资料包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、肿瘤分化程度。应用免疫组化方法检测HIF-1α和CEACAM1在91例口腔鳞状细胞癌中的表达及定位,并对免疫组化结果进行分析,评价蛋白的表达与临床资料之间的关系。检测30例舌鳞状细胞癌中VEGF-C表达,并与HIF-1α和CEACAM1在舌癌中的表达进行对比,统计分析HIF-1α与CEACAM1和VEGF-C在舌癌中表达的相关性,并进一步分析在HIF-1α高表达情况下,CEACAM1表达与肿瘤脉管生成的关系。 2.以人口腔癌为研究对象,检测人口腔癌中MVD和LVD以及脉管内皮细胞表型转化情况采用免疫组化方法,分别应用血管标记CD31和淋巴管标记LYVE-1检测口腔癌中血管和淋巴管生成情况,统计血管密度和淋巴管密度。免疫组化双标记和免疫荧光双标记检测新生脉管表型转化情况,并分析其与CEACAM1表达的关系。 3、以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞为研究对象,检测RNAi慢病毒干扰载体对Tca8113细胞HIF-1α基因的干扰效率 Tca8113细胞在37℃、5%CO2孵箱中培养,取生长状态良好的细胞以4×104／孔接种于6孔培养板中,每孔加入2m1DMEM培养基。48小时后,细胞融合率可达到30-50%。将细胞分为空白对照组、阴性载体对照组和干扰组,分别加入ENi.S.、NC-GFP-Lentivirus和HIF-1 a-RNAi-Lentivirus(复感染指数MOI为75),37℃、5%CO2孵箱中继续常规培养。每天倒置荧光显微镜观察细胞生长,通过观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况,评估感染效率。RNA干扰后第五天,通过观察GFP评估细胞感染率约为70-80%,收集细胞,提取细胞总RNA,应用Real time RT-PCR方法检测不同实验组中HIF-1α基因水平表达,Realtime RT-PCR数值分析采用标准曲线分析法。RNA干扰后第五天,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western-blot方法检测不同实验组中HIF-1α的蛋白表达水平。 4.以Tca8113细胞为研究对象,检测HIF-1α沉默对CEACAM1、VEGF-C基因和蛋白水平表达的影响 Tca8113细胞培养并感染慢病毒颗粒,RNA干扰后第五天,通过观察GFP评估细胞感染率约为70-80%,收集细胞,提取细胞总RNA,应用real time RT-PCR方法检测不同实验组中HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C基因水平的表达,real time RT-PCR数值分析采用标准曲线分析法。RNA干扰后第五天,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western-blot方法检测不同实验组中HIF-1α的蛋白表达,再次验证蛋白表达水平干扰效率。同时收集细胞,采用流式细胞术检测CEACAM1的表达。RNA干扰后第五天收集Tca8113细胞培养液上清,采用ELISA方法对分泌至细胞外的VEGF-C蛋白进行检测。分析三个不同实验组中Tca8113细胞HIF-1α、CEACAM1和VEGF-C在基因和蛋白水平表达情况,探讨HIF-1α基因沉默后对CEACAM1和VEGF-C表达的影响。 5.建立HIF-1α基因沉默的口腔癌裸鼠移植瘤模型并观察脉管生成及肿瘤进展观察口腔癌裸鼠移植瘤的增殖进展和荷瘤鼠生存情况,检测移植瘤增殖活性及CEACAM1和VEGF-C表达情况,观察肿瘤脉管生成情况及其形态结构和内皮细胞表型转化情况,分析HIF-1α基因沉默与CEACAM1和VEGF-C表达及脉管生成的关系。建立口腔癌裸鼠移植瘤模型：37℃、5%CO2孵箱中培养Tca8113细胞,将生长状态良好的细胞以4×104／孔接种于6孔培养板中,每孔加入2m1DMEM培养基。48小时后,细胞融合率可达到30-50%。将细胞分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,分别加入ENi.S.、NC-GFP慢病毒颗粒和HIF-1 a-RNAi慢病毒载体(复感染指数MOI为75),37℃、5%CO2孵箱中继续常规培养。在细胞生长状态良好时配制细胞悬液,细胞浓度为2×106个／ml,备用。5周龄的BALB/C nu/nu雌性裸鼠30只,(中国医学科学院实验动物研究所),分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,每组10只,注射0.1ml空白对照组、阴性对照组和干扰组Tca8113细胞悬液(细胞数量为2×105个)于裸鼠背部皮下。接种肿瘤细胞后,将裸鼠置于SPF饲养条件下饲养,每天观察裸鼠背部的成瘤情况并在成瘤后定期对肿瘤大小进行测量。四周后每组裸鼠中的5只分别乙醚吸入麻醉后进行荧光实时活体成像,然后脱颈处死,收集肿瘤标本。将收集的裸鼠肿瘤标本进行常规处理制备成蜡块,应用免疫组化方法检测三组裸鼠肿瘤标本中CEACAM1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1(抗鼠)和CD31(抗鼠)的表达,并计数评估MVD和LVD,观察其形态结构变化,免疫双标记法检测新生脉管内皮细胞表型变化,研究HIF-1α基因沉默后对裸鼠移植瘤血管和淋巴管生成及其形态学改变和正常化的影响。 6.观察口腔癌裸鼠移植瘤模型生存情况三组裸鼠每组剩余5只继续在SPF饲养条件下饲养,观察研究荷瘤鼠生存情况,并进行生存分析。结果： 1.HIF-1α在口腔鳞状细胞癌中高表达,并与CEACAM1和VEGF-C表达呈正相关 HIF-1α在肿瘤中高表达(口腔癌阳性率95%,舌癌阳性率100%),细胞核和细胞浆着色；CEACAM1在肿瘤中表达增高(口腔癌中阳性率为83.5%,舌癌阳性率80%),胞膜和胞浆着色；VEGF-C在肿瘤中表达增高(舌癌阳性率为90%),胞膜胞浆着色。HIF-1α表达与CEACAM1和VEGF-C呈正相关(r=1.26, P0.05; r=1.45, P0.05) 2. CEACAM1表达模式与口腔癌分化密切相关,并与肿瘤脉管生成和内皮细胞表型转化相关 CEACAM1在口腔高分化鳞状细胞癌中呈胞膜阳性表达,在中分化和低分口腔癌中呈胞浆阳性表达(P＜0.01)。在60例CEACAM1阳性的中分化和低分化癌中,有50例显示胞浆呈中到高表达,染色范围从33%到80%,与此形成鲜明对比的是在20例高分化癌中,16例显示胞膜阳性表达。在CEACAM1阳性病例中,CEACAM1阳性的脉管数量较阴性病例中显著增高(P＜0.001)；同时,CEACAM1阳性病例比CEACAM1阴性病例MVD和LVD都显著增加(P＜0.05)；CEACAM1和LYVE-1免疫荧光双标记显示双标记阳性脉管数量在CEACAM1阳性病例中数量增加(P＜0.001)；LYVE-1和CD31免疫组化双标记阳性脉管在CEACAM1胞浆阳性表达病例中升高(P＜0.001)。 3.RNAi慢病毒干扰载体有效抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表达 Real time RT-PCR和western blot检测Tca8113细胞系中HIF-1α干扰效率：RNA干扰基因沉默HIF-1α后,Tca8113细胞基因水平和蛋白水平HIF-1α表达均明显降低(P＜0.05),基因水平表达下降80%,蛋白水平表达降低50%。 4.基因沉默HIF-1α后CEACAM1基因水平和蛋白水平表达下调 Real time RT-PCR和FCM(流式细胞术)分别检测各组Tca8113细胞CEACAM1表达,干扰组较对照组CEACAM1在基因水平和蛋白水平表达均降低。FCM结果显示CEACAM1蛋白在空白对照组、阴性对照组和干扰组表达率分别为10.30%、12.73%和5.49%(P＜0.05)。 5.基因沉默HIF-1α后VEGF-C基因水平和蛋白水平表达下调 Real time RT-PCR和ELISA检测各组Tca8113细胞VEGF-C基因水平和蛋白水平表达,ELISA结果显示干扰组VEGF-C较对照组表达明显降低与空白对照组(P=0.029)和阴性对照组(P=0.032)比较具有显著差异性,表明HIF-1α基因沉默显著下调VEGF-C表达。 6.HIF-1α基因沉默组口腔癌裸鼠移植瘤模型中CEACAM1和VEGF-C表达显著下调,脉管生成明显减弱,形态结构有明显的正常化趋势免疫组化方法检测裸鼠移植瘤模型中CEACAM1、VEGF-C表达及脉管生成情况：干扰组较空白对照组和阴性对照组CEACAM1表达明显降低(P＜0.05),MVD和LVD明显降低(P＜0.05),并且形态趋于正常化,管壁完整,内皮细胞连续,管腔规则,直径变小。干扰组与对照组相比,管腔直径差异性显著(P＜0.001)。LYVE-1和CD31双标记阳性脉管在干扰组中显著减少(P＜0.05)。结果表明肿瘤HIF-1α基因沉默后,脉管生成受到抑制,并且新生脉管结构形态趋于正常。 7.HIF-1α基因沉默降低口腔癌裸鼠移植瘤增殖活性,降低肿瘤生长速度,延长荷瘤裸鼠生存期 RNA干扰组及阴性载体对照组和空白对照组裸鼠移植瘤生长曲线显示,干扰组移植瘤生长速度明显减慢(P＜0.05),可能与HIF-1α沉默导致受HIF-1α调控的细胞增殖相关基因活性降低,使得肿瘤细胞增殖降低。干扰组移植瘤Ki-67表达明显降低(P＜0.005),说明HIF-1α沉默导致细胞增殖活性减弱。裸鼠生存曲线分析显示：干扰组裸鼠生存时间较空白对照和阴性对照明显延长(P＜0.05)。结论： 1.HIF-1α在人口腔鳞状细胞癌中高表达,并且与CEACAM1和VEGF-C表达呈正相关。CEACAM1表达与肿瘤分化程度关系密切,并与肿瘤脉管生成相关。CEACAM1阳性病例中,血管和淋巴管生成显著增高,内皮细胞表型转化也更活跃,这表明在HIF-1α高表达口腔癌中,HIF-1α可能通过调控CEACAM1和VEGF-C的表达,促进肿瘤血管和淋巴管生成,并对肿瘤血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞表型转化具有重要作用。 2.体外实验显示HIF-1α基因沉默显著抑制HIF-1α基因水平和蛋白水平表达,同时随着HIF-1α表达降低,CEACAM1和VEGF-C在基因水平和蛋白水平表达均下调。这表明在人口腔癌中HIF-1α可以调控CEACAM1和VEGF-C表达,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能在口腔癌脉管生成中具有重要作用。 3.体内实验显示,HIF-1α基因沉默组口腔癌裸鼠移植瘤模型HIF-1α表达明显降低,肿瘤血管和淋巴管生成被显著抑制,并且脉管结构形态明显趋于正常,血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞表型转化也更趋稳定,同时,干扰组移植瘤CEACAM1和VEGF-C表达都明显下调,表明RNA干扰基因沉默HIF-1α后,通过下调CEACAM1和VEGF-C表达抑制肿瘤血管和淋巴管生成,并介导内皮细胞的表型转化,使肿瘤脉管系统形态结构趋于正常。HIF-1α基因沉默还显著降低裸鼠移植瘤增殖活性和生长速度,延长荷瘤裸鼠生存期,这表明HIF-1α基因沉默导致受HIF-1α调控的细胞增殖相关基因活性降低,使得处于静止期的肿瘤细胞比例增高,肿瘤增殖活性降低,延迟了肿瘤的异质性进展过程,有利于荷瘤鼠生存期延长。此外,干扰组移植瘤新生脉管系统形态结构趋于正常也会使其功能在一定程度上趋于正常,趋于正常化的脉管系统形成的微环境抑制了肿瘤细胞在乏氧环境下的异质性克隆筛选,也会延缓肿瘤的异质化进程,也有利于荷瘤鼠生存期的延长。 4.HIF-1α沉默通过下调口腔癌CEACAM1和VEGF-C的表达抑制口腔癌血管和淋巴管生成,促进新生血管和淋巴管结构功能的正常化,并能有效抑制肿瘤增殖活性和生长速度,延长荷瘤鼠生存期,因此,HIF-1α/CEACAM1/VEGF-C可能成为口腔癌治疗中的有效联合靶点。6国家自然科学基金资助项日(30572056)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.85
【图文】：

口腔鳞状细胞癌,口腔,胞核,中高

图1.HIF一la在癌旁正常口腔勃膜中低表达，胞核着色(A)，在口腔鳞状细胞癌中高表达，胞核胞浆着色(B)。400x，DAB显示表2.口腔鳞状细胞癌cEAcAMI和HIF一1a表达与临床资料的关系病例数CEACAM1HIF一la阴性阳性表达模式阳性阴911576胞膜胞浆86(95%)2650低中一高性别男63954654女28622422年龄三59岁36630232全60岁55946844肿瘤分期

口腔癌,低分化,胞浆,脉管

图2.cEACAMI在低分化口腔癌中呈胞浆表达(A)，在高分化癌中呈胞膜表达(B)在个别癌旁正常豁膜鳞状上皮棘细胞层以上呈胞膜表达(C)，浸润到上皮内的炎细胞也呈阳性表达。A，C640x，B，400x，DAB显色图3.CEACAMI阳性口腔癌中CEACAMI阳性脉管数量增多(A)，而CEACAMI阴性口腔癌中CEACAMI阳性脉管数量减少(B)。64Ox，DAB显色

口腔癌,脉管,阴性

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【参考文献】