纤维蛋白凝胶结合滑膜干细胞修复颞下颌关节盘穿孔的实验研究

发布时间：2020-08-26 17:23

【摘要】：大约70%的颞下颌关节紊乱病患者其病因与关节盘移位有关,通常会伴有关节疼痛和组织退行性变。严重颞下颌关节紊乱病患者往往伴有骨关节病和关节盘穿孔,需要通过手术来治疗,方法包括关节盘的修补/摘除,以及全关节置换等。相比手术治疗,使用组织工程技术在体内治疗关节盘病变导致的颞下颌关节紊乱病显得更有潜力。颞下颌关节盘是一种特殊的纤维软骨,与透明软骨或膝关节半月板有很大区别,因此不能照搬这两种软骨的组织工程研究模式。目前报道的颞下颌关节盘组织工程研究大多数都使用关节盘本体细胞作为种子细胞。体外研究发现关节盘来源的纤维软骨细胞在培养过程中会发生去分化现象,表现为细胞合成软骨基质能力下降以及相关基因表达下降,例如Ⅱ型胶原和软骨低聚基质蛋白(COMP)。此外使用软骨/纤维软骨来源的细胞会造成供体组织的损伤。滑膜来源的间充质干细胞(SDSCs)可以作为种子细胞用于软骨组织工程研究。和软骨细胞一样,SDSCs能够合成软骨低聚基质蛋白、连接蛋白,以及糖胺聚糖(GAG)。相比骨髓基质间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs),SDSCs具有更强的成软骨能力和体外扩增能力,因而在软骨组织工程研究中得到越来越多的重视。颞下颌关节滑膜中也可分离培养SDSCs。研究证实,颞下颌关节来源的SDSCs同样具有多向分化能力。本研究将使用颞下颌关节来源的SDSCs用于关节盘组织再生的研究。纤维蛋白凝胶是经美国食品及药物管理局(FDA)批准的一种可生物降解材料,在临床上广泛应用于伤口愈合。在软骨组织工程领域,纤维蛋白凝胶作为支架材料可促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成。纤维蛋白凝胶的主要缺点是生物力学性能较弱、在体外/体内都具有较快的降解速率,因此不适合单独作为支架材料使用。本研究尝试将纤维蛋白凝胶同海绵状的壳聚糖支架相结合,希望利用纤维蛋白凝胶的特性提高种子细胞在支架上的接种效率、细胞分布,以及细胞外基质的合成,检测这种复合支架用于组织工程研究的可能。为了评估本实验所构建的SDSCs/支架复合物在体内修复关节盘穿孔的能力,需要制备关节盘穿孔模型。由于直接在动物体内做关节盘穿孔并植入细胞复合物的研究要求较高,难以大规模开展,目前报道的颞下颌关节盘组织工程的研究大多数处于体外研究阶段。本研究使用颞下颌关节盘外植体的形式研究关节盘组织工程。本研究通过在大鼠关节盘外植体上制备关节盘穿孔模型,将这种细胞支架复合物植入关节盘缺损处,最后将关节盘外植体植入裸鼠皮下,以观察其修复能力。关节腔滑液为血清渗出物,其主要有效成分和血清类似。因此将关节盘游离出来,以器官培养方式在皮下培养,能够在一定程度上模拟关节腔内的环境。关节盘外植体植入2-4周后,对其进行组织学、免疫组织化学检测,了解有无纤维软骨样细胞外基质的形成以及材料和穿孔边缘整合的情况,以评估颞下颌关节滑膜间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架修复关节盘穿孔的能力。第一部分大鼠颞下颌关节滑膜间充质干细胞的体外培养及多向分化潜能的实验研究 [目的]探讨大鼠颞下颌关节滑膜间充质干细胞的分离、培养和多向分化能力,为关节盘组织工程提供种子细胞。 [材料和方法]从大鼠颞下颌关节盘双板区获取滑膜组织,采用组织块法和连续传代法进行培养和纯化SDSCs,记录细胞的形态。取生长良好的第三代SDSCs进行①成软骨诱导分化,Ⅱ型胶原免疫组化检测；②成骨诱导分化,茜素红染色检测：③成脂肪诱导分化,油红O染色检测。 [结果]①利用组织块法和连续传代法培养和纯化的SDSCs,细胞呈短梭状,形态均匀一致；②成软骨诱导分化细胞表达Ⅱ型胶原；③成骨诱导分化茜素红染色可见钙化结节；④成脂肪诱导分化油红O染色阳性。 [结论]从大鼠颞下颌关节滑膜中能分离出SDSCs,这些细胞具有多向分化能力,可作为软骨组织工程的种子细胞。第二部分纤维蛋白凝胶复合壳聚糖支架的制备及相关性能检测 [目的]探讨纤维蛋白凝胶复合壳聚糖支架的制备方法,为关节盘组织工程提供支架材料。 [材料和方法]将等量纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液混合,待纤维蛋白原聚合后形成凝胶。在冷冻干燥法制备的海绵状壳聚糖支架上滴加纤维蛋白原溶液,加入等量凝血酶溶液,聚合后即成纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架,用扫面电镜检查材料表面性状。 [结果]冷冻干燥后的壳聚糖支架呈为海绵状,充满孔隙。等量纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液混合后,在37℃10分钟即可形成透明、柔软有韧性的凝胶。一块壳聚糖支架可以结合50μL纤维蛋白原溶液和50μL凝血酶溶液,制成纤维蛋白凝胶/壳聚糖复合支架。扫面电镜显示纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架表面有凝胶充填于孔隙之间。 [结论]将等量的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液加入壳聚糖支架,待纤维蛋白原聚合后即可制备纤维蛋白凝胶/壳聚糖复合支架,其结构依然为多孔海绵状,可用于组织工程研究。第三部分纤维蛋白凝胶/壳聚糖复合支架对颞下颌关节SDSCs三维培养的影响 [目的]将颞下颌关节SDSCs植入纤维蛋白凝胶/壳聚糖复合支架,体外培养观察细胞在这种复合支架上生长状况。 [材料和方法]将等量SDSCs(2×106/支架)接种至纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架(实验组)和纯壳聚糖支架(对照组)后进行体外培养。接种8小时后,收集未贴附支架的细胞,计算细胞贴附率。在培养第7天使用FDA/PI染色,在激光共聚焦显微镜下观察支架表面以下100微米处细胞分布和数量。在培养的第1,7,14,21,和28天使用CCK-8试剂检测并比较两种细胞/支架复合物中细胞数量,评估细胞增殖情况。 [结果]实验组(97.28%)细胞在接种8小时其贴附率显著高于对照组(90.79%)。激光共聚焦检测显示在材料表面100微米以下,实验组较对照组的细胞数量更多,分布更加均匀。细胞增殖结果显示在三维培养的第1天到第7天,实验组和对照组中细胞增殖没有显著性差异。从第7天到28天,实验组细胞显著多于对照组。 [结论]纤维蛋白凝胶能够促进SDSCs在海绵状壳聚糖支架中的接种效率、细胞分布和增殖。第四部分颞下颌关节SDSCs在纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架中软骨分化能力的体外实验 [目的]对SDSCs接种的纤维蛋白凝胶/壳聚糖复合物进行体外软骨化诱导,检测SDSCs在这种支架材料中的软骨分化能力。 [材料和方法]将等量SDSCs(2×106/支架)接种至纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架(实验组)和纯壳聚糖支架(对照组)后进行体外软骨化诱导培养。使用倒置显微镜观察两组细胞支架复合物表面形态的改变。使用实时定量PCR法检测细胞支架复合物诱导28天后细胞的软骨相关基因(Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、SOX9)的表达。分别在诱导的第0,14,和28天定量计算细胞支架复合物的GAG/DNA比值,比较细胞合成GAG的能力。 [结果]体外软骨化诱导28天后,倒置显微镜观察可见实验组支架表面细胞基质团块更多,体积更大；实验组细胞在Ⅰ型胶原表达上显著高于对照组,其余两个基因表达没有明显差异。实验组GAG/DNA比值在第14天和第28天均高于对照组。 [结论]纤维蛋白凝胶能增强SDSCs合成软骨样基质的能力,有利于SDSCs向软骨方向分化。第五部分颞下颌关节SDSCs复合纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架修复关节盘穿孔模型的体内研究 [目的]以外植体方式制备关节盘穿孔模型,将细胞/支架复合物植入穿孔中,置入体内培养观察,评估其修复关节盘穿孔的能力。 [材料和方法]制备游离大鼠颞下颌关节盘并做直径2mm的标准化穿孔。制备细胞/支架复合物,将其植入穿孔内,将关节盘外植体用纤维蛋白凝胶包裹,植入裸鼠皮下。在第2周和第四周取出标本进行组织学检测。实验分组：SFC(SDSCs+fibrin+chitosan)组;SC(SDSCs+chitosan)组;FC(fibrin+chitosan)组；C(chitosan)组,以及F(fibrin)组。 [结果]HE染色显示SFC组和SC组在2周和4周时支架内都有细胞和细胞外基质分布；SFC组比SC组有更多的细胞外基质和更少的支架内空腔。在FC组、C组和F组支架中有少量宿主来源的细胞,未见修复组织形成。免疫组化染色和GAG特染显示在SFC组中Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原,Aggrecan,以及GAG染色均强于FC组。 [结论]SDSCs复合纤维蛋白凝胶/壳聚糖支架植入关节盘穿孔外植体模型,在体内培养条件下,显示了更强的软骨基质合成能力,可用于关节盘组织工程研究。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R782.6

【参考文献】