BMSCs和HUVECs复合HA-TCP支架共培养对大鼠颅骨缺损修复的成骨能力影响

发布时间：2020-08-28 08:11

　　目的:建立SD大鼠颅骨临界骨缺损模型,并植入纯HA-TCP支架材料与含种子细胞的HA-TCP支架材料,观察SD大鼠颅骨缺损组织的愈合情况、新生骨组织结构和骨密度的变化以及骨重建微环境中ALP、Col-I的表达以及Runx2、OCN的转录水平,初步研究BMSCs和HUVECs复合HA-TCP支架共培养技术构建的组织工程骨修复SD大鼠颅骨大面积缺损时的成骨能力,为探讨修复口腔颌面部临界骨缺损的治疗方法奠定前期研究基础。方法:建立SD大鼠颅骨临界骨缺损模型,根据植入支架材料的种类随机将实验对象分为4组:(1)A组为空白对照组,即只植入HA-TCP支架;(2)B组为共培养组,即植入BMSCs+HUVECs+HA-TCP支架;(3)C组为骨髓间充质干细胞组,即植入BMSCs+HA-TCP支架;(4)D组为脐静脉内皮细胞组,即植入HUVECs+HA-TCP支架。分别于术后4周、8周、12周通过Micro-CT扫描观察组织工程骨修复大鼠颅骨缺损组织的形态、骨质骨量的动态变化。并取相应批次大鼠的支架材料及其周围组织样本,通过HE和Masson染色观察不同时间点复合支架组织工程骨修复大鼠颅骨缺损愈合过程中组织形态和组成的变化,通过免疫组织化学染色观察不同时间点复合支架组织工程骨修复大鼠颅骨缺损愈合过程中Col-I的分布,并使用image-pro-plus 6.0图像软件量化免疫组织化学切片中Col-I的表达,通过ALP活性试剂盒检测愈合过程中新生骨组织中ALP活性,通过qPCR检测愈合过程中新生骨组织中Runx2和OCN的转录水平的动态变化。使用SPSS16.0软件统计处理分析数据,单因素方差分析比较各组间差异以及Tukey HSD检验差异的统计学意义。结果:本实验成功建立了SD大鼠颅骨临界骨缺损模型,成功率为98%。Micro-CT扫描分析结果显示B组骨痂形成速度最快,骨密度值显著高于C组和D组,A组骨组织愈合最慢,且骨密度值最低(P0.05),各组骨密度值均随时间增加而增高,而B组骨密度值上升速度最快;HE和Masson染色结果显示:与A组、C组、D组比较,B组三维空间逐渐被新生骨代替,支架材料周围分布较多排列不规则、较厚的骨小梁,支架材料内部长入较多的新生血管,B组骨痂成熟速度最快;Col-I免疫组织化学染色结果显示,术后第4、8、12周时A组Col-I基质染色阳性面积均较小,颜色较浅,B组Col-I染色阳性基质面积最大,染色最深,平均光密度值最高,与C组和D组比较差异具有统计学意义(P0.05),而随时间增加各组Col-I免疫反应阳性染色面积略下降;ALP蛋白活性结果显示,B组ALP的表达量随时间增加而升高,12周时达到高峰,C组和D组8周时上升较多,12周时趋于平缓下降,A组各时间段呈缓慢上升趋势,B组ALP蛋白活性均显著高于A组、C组和D组(P0.05);qPCR检测Runx2和OCN的转录水平结果显示,B组可有效促进骨重建微环境中Runx2和OCN的转录水平,其促进效果优于A组、C组和D组。结论:通过建立SD大鼠颅骨临界缺损模型并植入含或不含种子细胞的HA-TCP支架材料。观察大鼠颅骨缺损组织结构的变化、新生骨组织中ALP活力的变化、Col-I的表达、Runx2和OCN的转录水平的变化,探讨复合支架技术构建的组织工程骨对大鼠颅骨缺损修复的效果,现得到结论如下:BMSCs和HUVECs复合HA-TCP共培养构建组织工程骨能加速愈合骨痂形成、增加新生骨组织密度、获得良好的骨组织的生长;能诱导BMSCs向成骨细胞分化,促进骨重建微环境中ALP、Col-I的表达以及Runx2、OCN的转录水平;可能诱导复合支架材料内部新生血管的形成;能成功修复大鼠颅骨临界骨缺损。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【分类号】：R782
【图文】：

原代培养

西南医科大学硕士学位论文结果动物模型建立情况通过建立SD大鼠颅骨缺损模型，植入复合支架技术构建的组织工程察组织工程骨修复大鼠颅骨缺损组织愈合的情况。.1 复合支架组织工程骨的制作情况.1.1 倒置相差显微镜下 SD 大鼠原代 BMSCs 的形态观察SD 大鼠原代 BMSCs 分离培养 3 天后（图 1），可见树突状、三角形形细胞贴壁生长，且细胞有多个长短不一的突起，细胞核明显，细富，培养 7 天后可见细胞铺至瓶底约 90%，准备传代培养 (图 2)。

原代培养

共培养

图 3 HUVECs 培养第 3 天（40×）图 4 HUVECs 培养第 7 天（40×）igure 3 the 3rd days culture of HUVECs (40×) Figure 4 the 7th days culture of HUVECs (40×).1.3 倒置相差显微镜下共培养细胞的形态取第 3 代 BMSCs 和 HUVECs 共培养形态如图 5 和图 6，可见梭形UVECs 和三角形、多角形及树突状的 BMSCs，共培养 5 天后可见 BMS满培养瓶底，0.25%胰蛋白酶消化，将两种细胞接种于 HA-TCP 支架共培养 7 天后做的扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）。

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