D-缬氨酸对牙周及种植体周致病菌—牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响

发布时间：2020-08-28 16:44

　　研究背景:种植义齿已成为牙列缺损及牙列缺失患者的治疗首选~([1]),种植义齿十年存留率已达97.1%,但其生物学并发症并无明显降低~([2])。种植体周围黏膜炎及种植体周围炎导致种植失败的病例约占失败总数的30%以上~([3-4])。因此,要预防种植体周围黏膜炎及种植体周围炎的发生并阻止其进一步发展,以提高种植义齿存留率。与天然牙相似,种植体周围黏膜炎发生的始动因素也是颈部菌斑生物膜的形成。当种植体周发生炎症时,其主要菌群从G+菌转变为G-菌,其中牙龈卟啉单胞菌是被公认为与种植体周围炎症发生发展甚至种植体最终脱落关系最为密切的细菌~([5-6])。因此,如何有效地清除种植体表面的菌斑生物膜成为预防和治疗种植体周围炎的技术关键。近期研究发现微生物中含有多种D-氨基酸,但只在细菌生长进入平台期后D-氨基酸的含量才开始增多~([7])。枯草杆菌在生物膜分散期合成的D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸和D-色氨酸可抑制其游离细菌形成生物膜,并能触发成熟生物膜的分散~([8])。而这些D-氨基酸对生物膜的抑制作用可分别被对映异构的L-氨基酸抑制~([9])。而且不同个体的金黄色葡萄球菌对D-氨基酸的敏感性明显不同,D-氨基酸的联合使用可达到最佳的破坏生物膜的作用~([10])。D-氨基酸与生物膜之间的关系受到各大学者的关注,但D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用尚不明确。目的:本研究旨在探讨D-缬氨酸对牙周及种植体周致病菌-牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。研究结果可能为临床上预防和治疗种植体周围炎新药的研制提供理论依据。方法:本实验在脑心浸液培养基(BHI)中培养牙龈卟啉单胞菌(P.g ATCC33277),通过脑心浸液液体培养基进行增菌。并绘制牙龈卟啉单胞菌生长曲线,选择指数生长期的菌液进行下一步实验。通过对不同菌液浓度下形成的生物膜进行荧光显微镜观察,确定生物膜形成最佳的菌液浓度。结晶紫染色法检测D-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量的影响,苯酚硫酸法检测D-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜产生的胞外多糖含量的影响,并通过扫描电子显微镜观察D-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形态的影响。结果:1、牙龈卟啉单胞菌生长曲线在第48小时开始呈指数增长,在第60小时达到稳定期。2、牙龈卟啉单胞菌菌液浓度10~8CFU/mL形成的生物膜呈网格状结构,均匀,连接紧密。而菌液浓度10~7CFU/mL形成的生物膜结构,有的为异质网格状结构,不均匀,连接稀疏。然而,由10~9CFU/mL形成的生物膜是不规则的细菌聚集而没有特定的结构,生物膜连接不连续。3、D-缬氨酸在浓度≥20mM时抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的聚集,与对照组相比具有统计学差异(P≤0.05)。D-缬氨酸的抑制作用呈浓度依赖性。浓度越高,抑制作用越明显。D-缬氨酸在0.1mM至10mM的浓度范围内,牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量与对照组相比无统计学差异(P0.05)。4、D-缬氨酸在浓度≥50mM时降低了牙龈卟啉单胞菌胞外多糖的产量,与对照组相比,具有统计学差异(P≤0.05)。而D-缬氨酸在0.1mM至40m M的浓度范围内,与对照组相比,D-缬氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用无统计学差异。5、扫描电镜观察发现牙龈卟啉单胞菌的生物膜在对照组(0mM D-缬氨酸组)和0.1mM D-缬氨酸组之间没有明显差异,两组细菌生物膜均由多层细菌组成,细菌之间连接紧密。牙龈卟啉单胞菌的生物膜在1mM至40mM浓度的D缬氨酸作用下没有显著差异,由单层细菌组成,细菌数量明显减少,细菌之间连接疏松。在50mM到150m M浓度的D缬氨酸作用下,细菌生物膜聚集量显著降低,并且不能连接成膜。在100mM到150mM高浓度的D-缬氨酸作用下牙龈卟啉单胞菌形态改变。结论:1、D-缬氨酸浓度≥20mM时能降低P.g ATCC33277生物膜的生物量。2、D-缬氨酸浓度≥50mM时能减少P.g ATCC33277生物膜胞外多糖的产生。3、D-缬氨酸浓度≥1mM时,生物膜细菌数量明显减少,生物膜不连续。在100m M-150m M范围内,牙龈卟啉单胞菌形态改变。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R783.6
【部分图文】：

生长曲线,牙龈卟啉单胞菌,生长曲线

第 3 章结果第 3 章结果3.1 牙龈卟啉单胞菌的生长曲线P.g ATCC 33277 的生长曲线如图 3.1 所示。从第 24h-48h 牙龈卟啉单胞菌生长平缓，牙龈卟啉单胞菌从第 48 小时开始指数增长，在第 60 小时达到稳定期，从第 60h-76h 牙龈卟啉单胞菌生长一直处于稳定平台期。

缬氨酸,生物量,生物膜,生物膜形态

3.2 109CFU/mL(A),108CFU/mL(B) and 107CFU/mL(C) 菌液浓度g ATCC 33277 生物膜形态的荧光显微观察(×4,×10,×20,×3 结晶紫染色法测定不同浓度 D-缬氨酸对 P.g ATCC 33277 生物量的影响结晶紫染色法测定生物膜生物量结果如图 3.3。D-缬氨酸浓mM 时，P.g ATCC 33277 生物膜生物量显著降低，与对照组相统计学差异（P ≤0.05）。D-缬氨酸的抑制作用呈浓度依赖度越高，抑制作用越明显。D-缬氨酸浓度在 0.1mM 至 10mM 范围

缬氨酸,生物膜,生物量

结晶紫染色测定不同浓度D-缬氨酸对P.gATCC33277生物膜生物量的影响（*P<0.05）

【参考文献】