腺病毒介导的过表达hTERT牙周膜细胞系的建立及成骨能力初探

发布时间：2020-08-31 17:54

　　目的:1.通过腺病毒法建立过表达外源性人端粒酶反转录酶基因的牙周膜细胞系;2.与用慢病毒方法建立的过表达hTERT基因的牙周膜细胞系对比分析其成骨能力,以探索构建高效、稳定的更有利于牙周再生研究的牙周膜细胞系。方法:1.PCR方法扩增hTERT基因全长,构建重组腺病毒质粒pAdpshuttle-cmv-hTERT,包装腺病毒颗粒后感染人正常牙周膜细胞;2.检测hTERT mRNA的表达水平;3.检测碱性磷酸酶、骨桥素、骨钙素、骨涎蛋白、核心结合因子和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达水平;4.用成骨诱导液培养牙周膜细胞21天后,pH为4.1的茜素红染液染色10分钟,观察矿化结节的形成;5.CCK-8检测细胞增殖能力。结果:1.成功培养出原代牙周膜细胞;2.质粒测序结果与NCBI数据库hTERT(NM-198253.2)cDNA序列进行对比分析,与目的序列一致,成功构建了含hTERT基因的腺病毒颗粒并感染牙周膜细胞;3.感染细胞与正常牙周膜细胞形态相似,呈纤维状生长;4.qPCR结果显示hTERT及成骨相关基因在腺病毒介导牙周膜细胞中高表达,与正常细胞组及慢病毒介导的牙周膜细胞组相比有显著性差异;5.茜素红染色显示腺病毒构建的牙周膜细胞系成骨能力更强;6.CCK-8结果示腺病毒构建的牙周膜细胞系增殖能力强。结论:通过腺病毒法成功建立了过表达hTERT的人牙周膜细胞系,有较强的成骨分化能力,这为研究牙周膜再生机制提供了一个理想的细胞系,同时也为牙周病的治疗奠定了一定的研究基础。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

培养液,牙周膜细胞,消毒液,学位论文

究生学位论文腺病毒介导过表达 hTERT 牙周膜细胞系的建立过滤，接触病毒液的物品放入 84 消毒液中集中灭LEP 管中，封口，超低温下保存。增：吸取 1ml 病毒液再次感染细胞，同时以未作培养 7 天，期间若发现培养液不足添加适量培养液，转染病毒颗粒的细胞细胞核变大，包浆明显。按果ERT 重组质粒双酶切鉴定结果 pshuttle-cmv-TERT 经 KpnI 和 HindIII 双酶切鉴条亮带（图 2-1），与 hTERT 基因(3398bp)大小相近

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图 2-2：测序结果图 2-3：测序结果与 hTERT（NM-198253.2）cDNA 序列进行 Blast 对比2.3.3 同源重组腺病毒质粒酶切鉴定pAdEasy-1+pshuttle-cmv-TERT 同源重组质粒经 PacI 酶切后在 4.5kb 左右可见一条亮带（图 2-4），证明腺病毒质粒同源重组成功。

cDNA序列,cDNA序列,测序,同源重组

14图 2-3：测序结果与 hTERT（NM-198253.2）cDNA 序列进行 Blast 对比2.3.3 同源重组腺病毒质粒酶切鉴定pAdEasy-1+pshuttle-cmv-TERT 同源重组质粒经 PacI 酶切后在 4.5kb 左右可见一条亮带（图 2-4），证明腺病毒质粒同源重组成功。

【参考文献】