Periostin基因克

发布时间：2020-09-01 11:51

　　 Periostin又称为成骨细胞特异性因子2（osteoblast-specific factor 2， OSF-2），是近几年来新确定的一种骨粘附分子，其分于量约90kDa，主要由成骨细胞及其前体细胞所分泌产生，可有效促进成骨细胞的粘附和伸展，并特异地表达于骨膜和牙周膜组织，在骨及牙齿的形成过程中可能起着独特的作用。目前，学者们己从小鼠和人的cDNA文库中克隆到Periostin基因，该基因与昆虫胚胎的中枢神经系统粘附分子fasciclinⅠ属同一家族，结构中均含有4个相似的重复序列，且其主要功能均为细胞粘附作用。但 Periostin作为成骨细胞特异表达的分子，其在矿化组织形成中的作用尚不十分清楚，而有关这方面的研究正逐渐受到学者们的关注。本课题为了对 Periostin的结构与功能有更深入的认识，采用分子生物学技术，对小鼠 Periostin C端cDNA进行了克隆，原核表达和纯化，并制备了抗Periostin 抗体，进行了蛋白印迹（Western blot）和免疫组化的研究，从蛋白和分子水平探讨了Periostin的组织表达特异性，同时利用所获得的具有活性的 Periostin，研究了其对牙周膜细胞的一系列生物学效应，为今后进一步研究其生理功能和用于临床奠定了基础。本研究分为以下4部分：一、小鼠Periostin C端编码区cDNA克隆及其序列分析采用异硫氰酸胍一步法从成年昆明小鼠牙周组织中抽提总RNA，用 Oligo(dt)作引物逆转录合成cDNA，然后利用PCR技术，从cDNA中扩增出小鼠Periostin C末端编码区的基因片段（约940bp），将所得基因片段插入pRSET-B载体，转化大肠杆菌DH5α后随机挑选数个克隆，提取质粒 DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果表明：重组第凹军医大学博士学位论义一质粒pRSETE干eriostin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道的序列一致。二、小鼠互组Perinstin C端肤在大肠杆菌中的表达及活性鉴定将编码小鼠 Periostin C端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体 —”””——”————”’—””一’——～’ 一尽 pRSETS上，使其受控于 T7启动于，构建成表达质粒pRS七Ieriostin，以大肠杆菌 E．COlt BL21（DE3）为宿主菌。对工程菌用异丙基硫代一p—D一半乳糖苦（IPTG）诱导表达，表达产物纯化后进行复性处理，再通过观察成骨细胞的粘附性和伸展性检测其生物学活性。结果显示：经IP＊G诱导sh，工程菌在SDS．PAGE上出现一条新蛋白带，分子质量与预期的一致约为 36kDa，主要以包涵体形式存在，所得包涵体经纯化和复性处理，得到纯度高于 95％的小鼠重组 Periostin C端肽。为检测重组Periostin的活性，采用固相结合分析实验以及四陛盐比色（MTT法）等细胞生物学技术，观察成骨细胞在 Periostin基质上的粘附能力和伸展率。结果表明：成骨细胞在Perio悦in基质上的粘附和伸展良好，当浓度在20m勿L以上时，作用尤其显著（P＜0．01），与在纤维结合蛋白（FN）基质上生长相似。即小鼠重组Periostin可有效促进成骨细胞的粘附和伸展。三、抗Pertostin抗体的制合和组织裹达特异性研究以重组、纯化的小鼠Periostin为抗原，混入弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫新西兰大白兔：用双向免疫扩散试验检测抗体效价，将获得的多克隆抗血清初步纯化后，用Western blot和免疫组化检测小鼠Periostin的组织表达特异性。Western blot显示：在小鼠颅盖骨及牙周组织总蛋白中有特异性表达，而在肝、肾和脑组织总蛋白中没有表达。免疫组化检测，下颌骨表面骨膜和牙周膜组织中的Periostin染色呈强阳性，而在牙骨质、牙本质、第4页共98页第＊军医大学博士学位论义一牙槽骨和牙髓组织中则为阴性，提示Periostin在这两种组织中的高水平表 4。四、Periostin对人牙周膜细胞的生物学作用 1．为了了解小鼠重组 Periostin对牙周膜细胞（PDL细胞）粘附、伸展及移动的影响，我们采用了固相结合分析以及细胞机械创伤模型等方法， 0＿＿＿、＿、＿观察PDL细胞在Periostin基质上的粘附率。伸展率及其定向移动的能力。结果显示：Periostin可促进PDL细胞的粘附、伸展和移动，且当浓度在40 mg几时，作用最为显著。 2．应用Mry比色试验及酶动力学方法，测定了小鼠重组Periostin对 PDL细胞的增殖和 ALP活性的作用。观察到 Periostin仅在浓度为 40mg／L 时，可显著促进PDL 细胞的增殖，其余浓度则无作用，而其浓度在 10mg几－80mg几范围中时，均可显著提高 PDL细胞 ALP活性水平，说明小鼠重组Periostin对PDL
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R781.02

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