唑来膦酸通过TLR4介导巨噬细胞M1极化参与双磷酸盐相关性颌骨骨坏死的机制研究

发布时间：2020-09-17 12:54

　　双磷酸盐相关性颌骨骨坏死(Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw,BRONJ)是一种因长期注射双膦酸盐类药物引起的严重并发症,临床上,患者在经历牙拔除术后多表现为持续长达八周以上的经久不愈的开放性拔牙创,并伴有疼痛与局部炎症。外科手术切除与抗炎治疗尚不能起到关键性治疗作用。以往报道显示唑来膦酸主要通过抑制破骨细胞活性进而降低局部颌骨骨代谢水平最终导致BRONJ的发生。而近年来很多学者报道巨噬细胞也可能作为一个关键因素参与BRONJ的发生,但其具体的机制尚不清楚。因此,本实验通过研究唑来膦酸(Zoledronic Acid,ZA)诱导下的出现的M1型巨噬细胞极化及相关作用机制,从免疫学角度探究BRONJ发病的新机制。通过转录组水平筛选发现伴随M1巨噬细胞极化TLR-4(Toll-Like Receptor-4)的表达也明显升高,并进一步验证TLR-4介导的巨噬细胞M1极化参与小鼠BRONJ的发生,通过本实验研究,TLR-4可能作为新的靶点为临床上防治BRONJ提供更多实验基础以及新的思路。第一部分:唑来膦酸对小鼠骨髓巨噬细胞极化的影响。目的:体外分离培养小鼠骨髓巨噬细胞后检测ZA处理后小鼠BMDMs的极化状态。方法:骨髓贴壁法成功获取小鼠巨噬细胞之后,使用ZA处理体外培养成熟的BMDMs细胞,24小时之后通过流式细胞仪检测M1型(CD11c阳性)及M2型(CD206阳性)巨噬细胞表达比例的变化,分析ZA对于巨噬细胞极化的影响。提取极化诱导之后的巨噬细胞总蛋白,western blot实验检测M1型及M2型巨噬细胞标记物的表达。在以每孔接种60万细胞的24孔板中使用ZA进行巨噬细胞极化诱导,并通过细胞免疫荧光技术状态使用激光共聚焦显微镜观察对于BMDMs极化进行观察。提取经ZA处理的小鼠巨噬细胞培养液上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测巨噬细胞上清中TNF-α与IL-1β的表达量。结果:流式检测结果显示在ZA作用下巨噬细胞明显呈现出M1极化倾向,蛋白印迹实验验证了这一结果。细胞免疫荧光结果显示:ZA作用下的巨噬细胞呈现出M1极化增多,M2极化减少的趋势。同时,酶联免疫吸附试验(ELISA)显示ZA诱导的巨噬细胞分泌TNF-α以及IL-1β增多的这一结果。结论:体外培养的小鼠巨噬细胞在ZA处理后呈现出明显的M1极化趋势,并释放TNF-α与IL-1β等炎症因子。第二部分:唑来膦酸通过TLR-4/NF-κB信号通路调控巨噬细胞M1极化目的:通过检测ZA处理后的巨噬细胞Toll样受体(TLRs)表达水平的变化,筛选出ZA的可能作用通路,并分析其对于巨噬细胞极化的影响。方法:1、通过筛选ZA刺激巨噬细胞后Toll样受体家族基因转录组的表达量,筛选出变化较为明显的TLR-4。并通过western blot检测巨噬细胞在ZA作用下TLR-4/NF-κB信号通路的表达情况。使用荧光探针标记的ZA处理巨噬细胞,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对ZA的胞吞时间,同时提取细胞总蛋白验证甲羟戊酸通路发挥作用时间相与ZA激活TLR-4的时间关系,探究ZA对于巨噬细胞的作用机制。2、提取TLR-4全敲除小鼠巨噬细胞,通过western blot验证ZA对巨噬细胞极化状态及NF-κB通路的影响。3、使用TLR-4小分子抑制剂(TAK-242)和ZA共同处理的小鼠巨噬细胞,western blot检测TLR-4信号通路相关指标表达情况。结果:1、通过对TLRs家族转录组的分析,我们发现小鼠巨噬细胞中的TLR-4在ZA作用下呈现高表达趋势,并且TLR-4下游通路NF-κB被活化,表现出巨噬细胞M1极化趋势。通过激光共聚焦观测发现ZA首先激活巨噬细胞表面膜受体蛋白TLR-4进而被巨噬细胞胞吞,同期检测ZA处理巨噬细胞后的甲羟戊酸通路亦可得到这一结论。2、ZA无法极化TLR-4表达缺失的巨噬细胞,且TLR-4下游信号通路在ZA作用下无明显变化。3、TLR-4小分子抑制剂可以阻断由ZA引起的TLR-4信号通路活化。结论:ZA通过巨噬细胞膜受体TLR-4活化TLR-4/NF-κB信号通路,进而被巨噬细胞内吞。TLR-4表达缺失导致巨噬细胞无法被ZA诱导向M1极化。第三部分:唑来膦酸对TLR-4敲基因小鼠拔牙创愈合的影响。目的:通过构建小鼠BRONJ模型,观察野生型小鼠(WT)与TLR-4基因敲除小鼠(TLR-4~(-/-))颌骨拔牙创周围软组织中的巨噬细胞极化状态以及小鼠拔牙创愈合情况,进而确定TLR-4是否在BRONJ小鼠模型中扮演重要的角色。进一步研究体内预防性使用TLR-4抑制剂(TAK-242)对小鼠BRONJ的预防效果。方法:1、建立C57/B6小鼠BRONJ模型,并通过大体观测、影像学、组织学、整体发生率四个方面综合评估ZA处理后的野生型小鼠BRONJ的发病情况。2、同等标准条件下建立TLR-4~(-/-)小鼠BRONJ模型,通过大体观测、影像学、组织学、整体发生率四个方面综合评估ZA处理后的TLR-4~(-/-)小鼠BRONJ发病情况并与WT小鼠进行比较分析。3、对成功造模后的小鼠的颌骨拔牙创进行冰冻切片染色,采用激光共聚焦显微镜观察并统计WT和TLR-4~(-/-)小鼠BRONJ模型颌骨巨噬细胞极化的差异。4、WT小鼠诱导BRONJ模型在ZA给药前一周预防性使用TAK-242,与未给予TAK-242的处理的对照组对比BRONJ的发病率。使用激光共聚焦显微镜观察两组小鼠颌骨拔牙创周围软组织中巨噬细胞极性转化的差异。结果:1、成功建立小鼠BRONJ模型,与空白对照组相比,ZA处理后的小鼠拔牙创延迟愈合,拔牙创内部骨质空虚,组织学分析提示拔牙创周围生成较多死骨。2、相比WT小鼠,TLR-4~(-/-)小鼠中BRONJ发病率明显降低,拔牙创延迟愈合情况得到改善,死骨形成较少与WT组小鼠。3、冰冻切片染色结果显示WT小鼠拔牙创周围软组织中巨噬细胞呈现明显的M1型极化状态,TLR-4~(-/-)小鼠拔牙创周围软组织中可见M2型巨噬细胞浸润减少,但未见M1型巨噬细胞增多。4、对WT小鼠预防性使用TAK-242处理后小鼠BRONJ发病率明显降低。大体观、影像学、组织学均表现出拔牙创的愈合情况优于与未给予TAK-242的处理的对照组。同时,TAK-242的使用可以明显降低ZA诱导的小鼠拔牙创M1型巨噬细胞极化浸润。结论:TLR-4在小鼠BRONJ的发生发展以及拔牙创周围M1巨噬细胞的极化中扮演着重要的角色。TAK-242可以明显改善由ZA导致的小鼠BRONJ的发生,并且减少M1型巨噬细胞在拔牙创周围的浸润。以上研究结果为TLR-4作为新靶点防治BRONJ提供实验依据。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R782
【部分图文】：

巨噬细胞,硕士学位论文,细胞,伪足

南京医科大学硕士学位论文2 结果2.1 BMDMs 的形态特点全骨髓贴壁法获取的小鼠骨髓来源的巨噬细胞在培养初期可见大量单核细胞悬浮，培养 3日之后可见大量 M0 巨噬细胞（图 1.1-A），此时收获成熟的 M0 巨噬细胞进行 M1 极化诱导，可见巨噬细胞形态变圆润，细胞通透性下降（图 1.1-B）。将巨噬细胞进行 M2 极化诱导之后可见细胞伪足加长，细胞整体形态与 M-CSF 诱导出的细胞形态基本保持一致。（图 1.1-C）

巨噬细胞,标志物

南京医科大学硕士学位论文2.3 唑来膦酸促进了 M1 型巨噬细胞极化本实验旨在探究 ZA 对于巨噬细胞极化的影响，并分别采用流式细胞分选，western Blot，免疫荧光的手段去验证 BMDMs 极化情况。结果显示：在 ZA 处理 BMDMs 24小时后，M1型巨噬细胞占比明显升高（图 2.1 A-B），westernblot 检测 ZA 处理后的 BMDMs 巨噬细胞极化标志物，结果显示 M1 标志物CD86 表达上调，M2 标志物 CD206 表达下降（图 2.1 C-D）。细胞免疫荧光检测巨噬细胞极化数目，结果显示：ZA处理后的发生 M1型极化的 BMDMs 数量增加（图 2.1 E）。

巨噬细胞,炎症因子,分泌量

南京医科大学硕士学位论文A：流式细胞分选分析 M1 型与 M2 型巨噬细胞比例。B：对于流式细胞分选的统计。C，D：western blot 检测 ZA作用前后巨噬细胞中 CD86 与 CD206表达量的差异。E：细胞免疫荧光检测极化巨噬细胞数量，图中bar=100μm。2.4 唑来膦酸促进巨噬细胞 TNF-α、IL-1β 等炎症因子的分泌ZA 处理巨噬细胞 24 小时后收集细胞上清，ELISA 检测上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β 的表达量（图 2.2 A，B）

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