Toll样受体2,4与人牙龈上皮细胞内毒素耐受的关系初探

发布时间：2020-09-29 15:40

　　人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGECs)长期暴露于大量的细菌环境中,是防御病原微生物入侵牙周组织的第一道屏障。牙周炎是一种慢性感染性疾病,长期的细菌内毒素(lipopolysaccharide,LPS)刺激可能会诱使HGECs对后续刺激的反应性降低,即产生内毒素耐受。内毒素耐受的机制究竟是什么,是否与LPS的信号识别受体Toll样受体 2(toll-like receptor 2,TLR2)和 Toll 样受体 4(toll-like receptor 4,TLR4)有关,它将如何影响牙周炎症的发生和发展,目前尚不得而知。目的:本研究旨在建立一种HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨内毒素耐受在牙周组织炎症反应中的作用和机制,为进一步阐明牙周炎发生发展的免疫学机理提供实验数据。方法:1.利用酶消化法体外分离培养HGECs;检测角蛋白和波形丝蛋白的表达,以确定其生物学来源;并采用MTT法观察HGECs在体外的生长特性。2.采用 1μg/ml 牙拃卟啉单胞菌(Pophyromonasg gingivalis,P.gingivalis)LPS和/或1μg/ml大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)LPS重复刺激或交叉重复刺激,建立HGECs的内毒素耐受模型。利用ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6,和趋化因子IL-8表达水平的变化。3.采用逆转录PCR技术检测TLR2,4 mRNA在HGECs的表达;采用real-time PCR技术和流式细胞术检测HGECs产生内毒素耐受或交叉耐受后,TLR2,4 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:1.通过酶消化法分离培养的HGECs表达角蛋白,属于外胚层来源的细胞,在体外具有良好的增殖能力。2.1 μg/ml P.gingivalis LPS 或 1μg/ml E.coli LPS 刺激 HGECs 24h 后,细胞条件培养液中均可检测到IL-1β、IL-6和IL-8,三种细胞因子的分泌水平均较刺激前明显增高(p0.05)。上述两种LPS重复刺激或交叉重复刺激后,IL-6和IL-8的表达水平均较单次刺激后明显降低(p0.05);1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,IL-1β的分泌水平也较单次刺激后明显降低(p0.05)。表明,内毒素耐受模型的构建是成功的。3.来自不同个体的HGECs 均表达TLR2,4mRNA。1μg/ml P.gingivalis LPS刺激HGECs后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(p0.05);1μg/ml E.coli LPS刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也明显上调(p0.05)。1μg/ml P.gingivalisLPS重复刺激后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平较单次刺激后明显降低(p0.05);1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也较单次刺激后明显降低(p0.05)。结论:本研究首次构建了 HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨了内毒素耐受对牙周组织炎症和免疫反应的影响,及其作用机制。研究结果显示,P.gingivalis LPS和(或)E.coli LPS重复刺激能诱导HGECs产生内毒素耐受,不同程度的抑制细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌,这种耐受可能与TLR2,4表达水平的降低有关。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R781.42
【部分图文】：

体外培养,第二代,外胚层,中胚层

图３体外培养的第二代ＨＧＥＣｓ邋（１００ＥＣｓ的来源鉴定逡逑丝和角蛋白分别是中胚层和外胚层来源细ＨＧＥＣｓ抗人角蛋白单克隆抗体染色阳性（图体染色阴性（图５），证实其为外胚层来

原代培养,斑块状,卵圆形,核仁

可见细胞数量明显增多，呈斑块状分布。生长良好的ＨＧＥＣｓ呈典型的“铺逡逑路石状”，细胞扁平，细胞核大而清晰，位于中央，呈圆形或卵圆形，有逡逑数个核仁（图１－３）。逡逑１７逡逑

波形,体外培养,第二代

图１原代培养３天的ＨＧＥＣｓ邋（４０Ｘ）邋图２体外培养的第二代ＨＧＥＣｓ邋（邋４０Ｘ）＿逡逑图３体外培养的第二代ＨＧＥＣｓ邋（１００Ｘ）逡逑１．２．２邋ＨＧＥＣｓ的来源鉴定逡逑波形丝和角蛋白分别是中胚层和外胚层来源细胞的特异性标志。本逡逑实验所获得的ＨＧＥＣｓ抗人角蛋白单克隆抗体染色阳性（图４），抗人波形逡逑

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