一氧化碳释放分子3对白介素-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞基质金属蛋白酶的作用及其机制初探

发布时间：2020-10-08 17:23

　　 实验背景颞下颌骨关节炎是影响整个关节的复杂病症,通过检查可发现关节内骨、软骨和关节盘均有退行性改变,并且最终结局之一为关节软骨的丧失。白细胞介素-1β是颞下颌骨关节炎中最重要的细胞因子之一,可通过上调几种炎症介质和蛋白水解酶的表达,如MMP-3、MMP-9、MMP-13,因此,阻断IL-1β或IL-1β诱导的炎症可能有效地减轻OA的进展。有研究证明,CO能够抑制细胞凋亡以及炎症反应等,一氧化碳释放分子3能够在生理环境下可控地释放CO,模拟生理条件下CO的作用。尽管一氧化碳释放分子3在抗炎方面研究广泛,但是其能否对IL-1β引起的软骨破坏起到保护作用,目前还不十分清楚。目的探究一氧化碳释放分子3对白介素-1β诱导的髁突软骨细胞的基质金属蛋白酶表达的调控作用及其作用机制。材料与方法采用3-4周龄的雄性Wistar大鼠体外培养制备髁突软骨细胞,应用显微镜观察其体外培养情况,并用细胞形态学方法和甲苯胺蓝染色法,以鉴定分离、培养的细胞为髁突软骨细胞。通过细胞增殖实验测定不同浓度(0、100、200、400、800μM)CORM-3对髁突软骨细胞的毒性作用。运用实时定量PCR检测0、5、10、20ng/ml的IL-1β刺激24h后各组细胞中MMP-3、9、13的mRNA表达量。根据结果选用1Ong/ml作为IL-1β的后续实验浓度。用qRT-PCR、Western Blot法检测200μM CORM-3对IL-1β诱导的髁突软骨细胞MMP-3、9、13 mRNA和蛋白表达的影响。运用Western Blot法检测10ng/ml IL-1β3刺激细胞5min、10min、30min后细胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表达量,根据结果选用1Omin作为后续实验MAPK通路激活的时间。用Western Blot法检测CORM-3、SP600125、SB203580、U0126对IL-1β诱导的髁突软骨细胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表达量及MMP-3、9、13的mRNA表达量和蛋白表达量的作用。结果(1)原代培养的大鼠髁突软骨细胞贴壁生长,细胞不均匀分布,呈多角形,类圆形细胞较少,形态欠规则;细胞生长至第8天左右,出现“铺路石样”特征;甲苯胺蓝染色,培养细胞呈异染性,证明培养的细胞为髁突软骨细胞;(2)细胞增殖实验表明200μM的CORM-3对髁突软骨细胞无明显细胞毒性;(3)10ng/ml IL-1β可显著增强大鼠髁突软骨细胞MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达;(4)200μM的CORM-3可显著抑制IL-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 的表达。(5)1Ong/ml IL-1β在1Omin时显著激活MAPKs信号通路。(6)2000μM CORM-3可显著抑制P38、ERK信号通路的激活。结论CORM-3通过抑制P38、ERK信号通路来显著下调IL-1β诱导的髁突软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,为颞下颌骨关节炎的治疗提供了新的思路。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R782.6
【部分图文】：

逡逑图１－１．大鼠髁突软骨细胞的分离培养Ａ．原代培养大鼠髁突软骨细胞；Ｂ．细胞形态多呈多逡逑边形；Ｃ．细胞出现“铺路石样”改变。逡逑２．髁突软骨细胞的甲苯胺蓝染色的鉴定逡逑第二代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后，可见单层细胞生长区内，细胞质与细胞逡逑外基质呈紫兰色，细胞核大而圆，呈深蓝色，细胞呈多边形，据此鉴定分离的细逡逑胞为软骨细胞（图１－２）。逡逑－逡逑图１－２．经甲苯胺蓝染色鉴定的软骨细胞（ｘｉｏｏ），细胞核呈深蓝色，细胞质及逡逑细胞外基质呈紫兰色。逡逑讨论逡逑关节软骨是一种不同寻常的组织，缺乏自我修复能力，软骨细胞含量较少，逡逑细胞外基质较多，其基质的特性主导其功能和生物学特性［３Ｇ］。本实验采用序贯逡逑酶消法获得了纯度较高的大鼠髁突软骨细胞。形态学观察结果发现，由于软骨细逡逑胞在体内和体外环境的差异，细胞表型并不能长久地保持一致，在３代以前生长逡逑良好

第二代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后，可见单层细胞生长区内，细胞质与细胞逡逑外基质呈紫兰色，细胞核大而圆，呈深蓝色，细胞呈多边形，据此鉴定分离的细逡逑胞为软骨细胞（图１－２）。逡逑－逡逑图１－２．经甲苯胺蓝染色鉴定的软骨细胞（ｘｉｏｏ），细胞核呈深蓝色，细胞质及逡逑细胞外基质呈紫兰色。逡逑讨论逡逑关节软骨是一种不同寻常的组织，缺乏自我修复能力，软骨细胞含量较少，逡逑细胞外基质较多，其基质的特性主导其功能和生物学特性［３Ｇ］。本实验采用序贯逡逑酶消法获得了纯度较高的大鼠髁突软骨细胞。形态学观察结果发现，由于软骨细逡逑胞在体内和体外环境的差异，细胞表型并不能长久地保持一致，在３代以前生长逡逑良好，在３代以后出现去分化现象，细胞形态由多角形逐渐变为长梭形，细胞的逡逑这种特质提示我们在三代以内的细胞可能是适合作为实验研宄的细胞，为进一步逡逑研究大鼠髁突软骨细胞的其他的生物学特性和颞下颌骨

山东大学硕士学位论文计学意义。逡逑结果逡逑鼠髁突软骨细胞的毒性作用逡逑，ＣＯＲＭ－３浓度在１００？４００＾Ｍ之间对髁突软骨＾ｉＭＣＯＲＭ－３有促进细胞增殖的作用，吸光度（Ｐ＜0．0５）。ＣＯＲＭ－３浓度在４０0ｈＭ时大鼠髁８００ｆｉＭ邋ＣＯＲＭ－３组可抑制大鼠髁突软骨细胞的００ｐＭＣＯＲＭ－３作为实验浓度进行后续实验。逡逑０．８－．逡逑

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本文编号：2832533