卵黄免疫球蛋白IgY改善实验动物牙周炎和口臭的研究

发布时间：2020-10-11 11:28

　　 IgY(Immunoglobulin of Yolk,IgY)是卵生动物主要免疫球蛋白,功能上等同于哺乳动物进化上的高级IgG,卵生动物IgY通过卵黄传输至胚胎,成为保护胚胎不受外界病原菌侵袭的抗体。鸡抗体IgY的收集和分离快速而经济,母鸡经特定微生物免疫后,从免疫母鸡的蛋黄中能获得效价高而持久的IgY抗体,被应用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤和免疫检验。基于免疫球蛋白IgY的体内外功效作用,发现特异性IgY改善口腔厌氧致病菌(Porphyromonas gingivalis,Prevotella intermedius和Fusobacterium nucleatum)感染的大鼠牙周炎和口臭的典型症状,阐明IgY治疗口腔疾病的作用。1.免疫球蛋白IgY的制备和生物化学特性。P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum菌液加入甲醛和弗氏佐剂,制成灭活疫苗,分3次免疫优质来杭蛋鸡(Leghorn),收集鸡蛋,分离蛋黄,采用0.01 mol/L pH5.0的醋酸缓冲液充分搅拌,4℃冷藏沉降脂质物质,离心后收集上清液,采用100 kDa孔径透析进行浓缩,获得IgY,经真空冷冻干燥和ELISA效价检测,其含量为360 mmol/L,对P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum的效价分别为1:25600、1:12800和1:25600。SDS-PAGE显示IgY的分子量180 kDa,由两条重链(67-70 kDa)和两条轻链(25kDa)组成。2.免疫球蛋白IgY作用实验动物的免疫特性。以IgY作为体外入侵抗原,检测Wistar大鼠血液中CD4~+和CD8~+的数量和比值,免疫调节因子组胺、IgM、IgE和IgG等的变化,分析IgY可能引起的Wistar大鼠的免疫应答,新西兰兔的皮肤刺激和豚鼠的皮肤变态反应,评价样品的急性、多次皮肤刺激和皮肤变态反应强度,评价IgY对实验动物的免疫作用特性。结果显示,实验组和对照组的大鼠体重和进食量均无显著变化,组胺和IgM在第9天显著升高后恢复正常水平,IgG和IgE基本无变化,CD4~+和CD8~+细胞数量分别为1902.60和974.00、免疫细胞中占比为54.36%和27.83%,CD4~+/CD8~+比值为1.95,都显著低于阳性对照(p0.05),且在正常范围内。皮肤刺激试验急性1-72 h、慢性1-14 d均无刺激,皮肤变态试验激发后24 h和48 h有2例积分2的动物,属于微弱变态反应。免疫应答、皮肤刺激和皮肤变态试验结果表明IgY不会引起大鼠的免疫应答,对新西兰兔皮肤无刺激性,对豚鼠皮肤有微弱的变态反应,当IgY的含量降低时其皮肤变态反应将得到有效控制,表明IgY作为外来抗原对机体无致敏性。3.免疫球蛋白IgY治疗大鼠牙周炎的功效。用口腔厌氧致病菌P.gingivalis,P.intermedius和F.nucleatum建立大鼠牙周炎动物模型,给药期间,每周探针检测并记录牙龈指数(GI)、菌斑指数(PI)和探诊出血指数(BOP),ELISA试剂盒测定血液中IL-6和TNF-α的含量,取组织固定,采集X射线标本数码照片,观察牙槽骨吸收情况,制作病理切片,观察牙周组织的病理变化情况。结果显示给药后GI、PI和BOP的分数分别降低90.00%、81.82%和100.00%,血液中IL-6和TNF-α的浓度降低63.04%和54.05%,与对照组相比,特异性IgY能够显著降低(p0.05)GI、PI和BOP指数,有效改善牙龈炎症、菌群共聚和牙周组织出血等症状,缓解牙周炎大鼠牙周组织病变,并可促进新牙周纤维及新骨的生成,减轻因牙周炎造成的炎症应答,表明IgY对口腔致病菌介导的牙周炎有显著的预防和治疗作用。4.免疫球蛋白IgY对口臭动物模型的影响。基于口臭的发病机理,采用P.gingivalis、P.intermedius和F.nucleatum诱导,饮用蔗糖水促进口腔厌氧致病菌定植的方式,制备大鼠口臭模型,给药IgY,检测GI、PI和口臭指数(HI)的变化,顶空固相萃取-气相色谱质谱联用技术(SPME-GCMS)发现大鼠口臭模型的口腔中厌氧致病菌代谢物的种类和含量变化,ELISA试剂盒检测血液中IL-6和TNF-α水平。结果显示,口腔中厌氧致病菌代谢物,主要由醛类、酮类、羧酸类和含氮化合物类组成,给药后GI、PI和HI的评分减少55.67%、57.14%和50.00%,血液中IL-6和TNF-α的浓度降低74.44%和85.09%,口腔中厌氧致病菌代谢物变化最大的有正己醛、2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、乙酸、正己酸、氨和乙烯基异丙基醚,相对含量分别降低8.84%、7.84%、8.11%、11.24%、8.51%和12.00%,且高剂量降低的百分比大于低剂量,表明特异性IgY能有效缓解由口腔厌氧致病菌引起的口腔健康问题和代谢物产生的异味,对口腔厌氧致病菌介导的口臭具有预防和治疗的功效。5.免疫球蛋白IgY抑制口腔厌氧致病菌增殖特性的研究。以人工唾液为培养基,模拟在口腔环境中不同剂量IgY对P.gingivalis、P.intermedius和F.nucleatum三种口腔厌氧致病菌以及组合菌液的增殖抑制作用,气味扫描仪(E-Nose)对人工唾液模拟体系中气味轮廓成分进行主成分分析,GCMS分析人工唾液模拟体系中口腔厌氧致病菌的代谢产物挥发性有机物(VOCs)的种类以及含量变化,Halimeter检测人工唾液模拟体系中口腔厌氧致病菌的代谢产物挥发性硫化物(VSCs)的含量变化。结果显示P.gingivalis在人工唾液中呈S型生长曲线,HI指数呈现逐渐上升的趋势;添加三种剂量IgY后,能够有效抑制口腔厌氧致病菌在人工唾液模拟体系中的增殖,尤其是高剂量IgY在6 h可显著抑制(p0.05)口腔厌氧致病菌的生长繁殖;气味扫描仪对人工唾液模拟体系中气味轮廓成分主成分分析显示IgY给药组能与对照组显著区分,且具有浓度依赖性,VOCs的种类有酮类、羧酸类、酯类、芳香族和含氮化合物,其中2,4-二叔丁基苯酚、1,4-二氧代全氢吡咯并[1,2-a]吡嗪、反式芥酸酰胺、5-氯-3-溴-1-[(4-甲基苯基)磺酰基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶和十一烷变化量最大,分别降低1.01%、1.43%、1.13%、0.94%、1.15%、0.72%,不同剂量给药组的VSCs的含量比对照组降低16~44%,表明人工唾液模拟体系中气味成分发生了明显的变化,特异性IgY有效降低口腔厌氧致病菌中VSCs和VOCs的产量,通过抑制口腔厌氧致病菌的增殖,降低致病菌代谢物的产生,缓解由代谢物引起的口腔炎症和异味,阻断口腔疾病的发生。比较IgY与鱼精蛋白、乳铁蛋白和甲硝唑3种抑菌剂的抑菌作用,结果显示高浓度的IgY对P.gingivalis和F.nucleatum的增殖有显著的抑制,而高浓度的乳铁蛋白对P.intermedius的增殖有显著的抑制,但当浓度降低后,中低浓度的IgY对P.intermedius增殖的抑制能力明显大于中低浓度的乳铁蛋白,表明IgY的抑菌能力更加出众。响应面法优化IgY对口腔厌氧致病菌的抑制,结果显示IgY在165-181mmol/L的剂量下能够最大限度抑制口腔厌氧致病菌的增殖和代谢物的产生。母鸡经特定微生物免疫后,产生特异性抗体IgY,浓缩和聚集在蛋黄中,收集鸡蛋,提取纯化IgY,含量高,特异性强,对实验动物没有刺激和过敏反应,作用于牙周炎和口臭动物模型,能明显改善牙周炎和口臭的典型症状,体外人工唾液模拟体系中特异性的抑制三种口腔致病菌的增殖和代谢物的释放,免疫球蛋白IgY通过抑制口腔厌氧致病菌增殖治疗实验动物牙周炎和口臭等口腔疾病。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.42;R781.9
【部分图文】：