猪牙本质基质蛋白提取物的分离纯化及活性检测

发布时间：2020-10-13 08:26

　　 牙齿的发育及牙胚的细胞分化是一系列口腔上皮和外胚层间充质组织细胞间相互作用的结果。牙本质形成过程中,成牙本质细胞的分化、成熟,分泌基质,以及诱导羟基磷灰石晶体沉积,都是由多种基质蛋白相互影响共同参与完成。牙本质有机基质决定其形态并且是矿物形成的基本物质。有机基质主要是胶原,非胶原基质约占10 %,它在牙本质的生物矿化过程中起着模板和调节作用。目前对非胶原蛋白的研究大多集中在单一蛋白质的生物特性,但仍没有发现牙本质形成的核心蛋白,对于非胶原蛋白的混合作用研究不多。本研究采用组织蛋白提取方法从牙本质蛋白中获得DMPCs,并利用体外实验初步检测混合蛋白相互作用对hDPSC生长的影响,观察其生物活性。 1牙本质基质蛋白的提取和分离纯化 取六龄猪上下颌磨牙牙胚,4℃进行蛋白分离,磨碎后采用EDTA/盐酸胍浸泡提取牙本质蛋白,浸泡提取7d后取上清,分别标记并加以浓缩,利用ATKA蛋白纯化分析仪分离纯化蛋白质,经PBS透析后浓缩以备用。经SDS-PAGE电泳图谱检测,根据相对分子质量与相对迁移率的关系,可以计算出相对分子质量分别为: 96Kda、38Kda、20Kda以及小分子,其中20Kda的染色条带最重。与文献中常见DSP、DPP相对分子量接近。说明EDTA提取法能够提取到多种非胶原蛋白,同时分子量检测证实能够建立一条稳定提取DMPCs的方法。 2 DMPCs对hDPSC生长的影响 设置4个实验组:使培养基内DMPCs终末浓度分别为50μg/ml、100μg/ mL、150μg/ml、200μg/ml,并以2%FCS的DMEM培养液作对照组,利用MTT法、ALP法分别检测DMPCs对hDPSC生长的影响。结果显示,1d、3d时100μg/ml促进hDPSC增殖的能力与对照组比较有显著差异(P0.05),5d作用不明显,结合hDPSC生长曲线考虑是生长饱和所致。从线性关系上分析,DMPCs对hDPSC的作用是呈递进关系的,提示一定浓度的DMPCs可以促进牙髓干细胞增殖,在牙髓干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的过程中发挥作用,促进牙本质形成。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R78
【部分图文】：

果质的分离和纯化 所示，蓝色曲线表示蛋白质在 OD280nm 的吸收曲线，2有 2 组较高浓度蛋白析出；灰色曲线表示离子浓度电导曲DTA 析出的表示。图 2 中蓝色曲线表示蛋白质在 OD280n可见在 80-100ml 段有较高吸收峰，说明该处蛋白浓度较峰说明还有低浓度蛋白析出；绿色曲线表示洗脱液的含量示盐浓度变化曲线。

图 2 Q-Sepharose Fast Flow column 层析曲线相对分子量（SDS-PAGE 检测）得到的 SDS-PAGE 电泳图谱见图，可见深浅不均的染子质量与相对迁移率的关系，可以计算出相对分子质da、20Kda 以及小分子，其中 20Kda 的染色条带最

图 1 牙本质基质蛋白提取物对人牙髓干细胞增殖的影响3.3 DMPCs 对 hDPSC ALP 活性的影响分析表明，牙本质基质提取物对人牙髓干细胞内 ALP 活性有促进用。培养 1d 时，100μg/ml 组可促进人牙髓干细胞 ALP 活性(P<0.05)，养 3d 时 100μg/ml 和 150μg/ml 均可促进人牙髓干细胞 ALP 活性(P <0.0其它各实验组于对照组没有显著性差异(P > 0. 05)。表 2 牙本质基质提取物对人牙髓干细胞 ALP 活性的影响（OD:410nm）实 验 组实验天数50μg/ml 100μg/ml 150μg/ml 200μg/ml对照组1d 0.332±0.004 0.523±0.007a0.374±0.005 0.379±0.010 0.355±0.3d 0.558±0.005 0.762±0.007b0.729±0.008b0.537±0.002 0.590±0.
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本文编号：2838953